分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法、装置及应用与流程

本技术涉及移植免疫检测，特别是涉及一种分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法、装置及应用。

背景技术：

1、胰岛移植是治疗і型糖尿病的有效手段，但移植物常因免疫排斥而逐步丧失功能。对移植后免疫活化程度的评估，临床上主要依赖血糖、c肽等功能指标以及移植物活检的组织学观察，前者滞后且不能反映分子层面的免疫活化，后者为有创操作且难以连续开展。

2、基于转录组的分析可在分子层面反映移植物免疫状态。然而，现有基于转录组的移植物免疫评估多停留在差异表达基因罗列或通路富集的定性层面，缺少固定的基因组合、明确的评分计算规则与可复现的分型阈值，导致不同样本、不同批次之间的结果难以直接比较，也难以作为标准化工具在装置和试剂盒中固化落地。

3、因此，需要一种以固定基因组合和明确评分规则为基础、能够将移植物免疫活化的分子状态转化为可复现的连续评分和离散分型的技术方案。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种新的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法、装置及应用。

2、为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、本技术公开了一种分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法，包括以下步骤：

4、归一化表达矩阵分析步骤，包括获取基于移植物组织产生的单细胞转录组表达数据，对其进行质量控制和对数归一化，得到归一化表达矩阵；

5、确认抗原呈递转化基因组步骤，包括从归一化表达矩阵中确定抗原呈递转化基因组，抗原呈递转化基因组包括主要组织相容性复合体i类分子基因、抗原加工转运基因、免疫蛋白酶体基因、转录激活因子基因和干扰素应答基因；

6、抗原呈递转化评分步骤，包括对抗原呈递转化基因组中的每个基因，以该基因在参考细胞群中表达值的均值和标准差，将目标细胞群中各细胞该基因的表达值减去均值再除以所述标准差，得到标准化得分，并对同一细胞在抗原呈递转化基因组内各基因的标准化得分以相同权重求算术平均，得到该细胞的抗原呈递转化评分；目标细胞群为所述移植物内指定的一种或多种细胞类型；参考细胞群为参考数据集中对应目标细胞类型的细胞集合，参考数据集包含第一免疫状态移植物组与第二免疫状态移植物组，第一免疫状态移植物组与第二免疫状态移植物组为同种异体移植物与同系移植物的组合、或者排斥移植物与非排斥移植物的组合、或者活动性排斥移植物与耐受移植物的组合；

7、分子状态分型判断步骤，包括以在独立于待分型数据的参考数据集上预先确定的阈值，将目标细胞群中的各细胞划分为抗原呈递激活状态或静默状态，得到分子状态分型；

8、排斥相关分子状态指数计算步骤，包括将处于抗原呈递激活状态的细胞数除以目标细胞群中通过质量控制的细胞总数，得到抗原呈递激活细胞比例，作为移植物的排斥相关分子状态指数；

9、输出步骤，包括输出分子状态分型和排斥相关分子状态指数，作为移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的量化结果。

10、需要说明的是，本技术方法，通过固定的抗原呈递转化基因组组合、抗原呈递转化评分和预先确定的阈值，将定性的抗原呈递样转化转变为可复现、可跨样本比较的连续评分与离散分型，使不同样本、不同批次的结果可直接比较。在本技术的一些实现方式中，利用本技术的方法进行胰岛移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态分析，评分对同种异体与同系移植物胰岛细胞的区分曲线下面积达0.896；该基因组冻结后在独立小鼠肾移植排斥队列上迁移验证的曲线下面积达0.969。

11、还需要说明的是，本技术方法最初是基于小鼠胰岛移植的单细胞转录组表达数据进行研发；进一步的，可经同源映射延伸至人等其他物种的移植物分析；本技术的验证实施例覆盖了人肾移植活检的真实临床样本，未来在积累更多公开人胰岛移植数据后可进一步实施人胰岛验证。再进一步的，研究发现该方法不仅适用于胰岛移植的细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态分析，也适用于其它移植物细胞的分析，例如内皮细胞、髓系细胞和间质细胞等。

12、还需要说明的是，本技术方法的输出步骤得到的结果为离体转录组数据所反映的细胞分子状态参数，其本身不构成对个体移植物排斥、耐受、移植物功能或临床结局的诊断、预后预测或治疗决策；本技术方法不包括根据量化结果确定受试对象是否发生移植物排斥的步骤。本技术的输出可用于移植物免疫活化状态的标准化评估、研究用途或药物筛选等非临床诊断目的。

13、本技术中，第一免疫状态移植物组与第二免疫状态移植物组的组合方式包括但不限于：

14、（i）同种异体移植物与同系移植物；

15、（ii）排斥移植物与非排斥移植物；

16、（iii）活动性排斥移植物与耐受移植物。

17、在本技术中，“第一”、“第二”仅用于区分两种不同的免疫状态组，并不限定其优劣、先后或任何生物学等级。可以理解，其他具有不同免疫状态的可成对区分的移植物组合同样适用于本技术。

18、本技术的一种实现方式中，当检测对象为小鼠时，主要组织相容性复合体i类分子基因包括b2m、h2-k1、h2-d1、h2-q7和h2-t23；抗原加工转运基因包括tap1、tap2、tapbp和tapbpl；免疫蛋白酶体基因包括psmb8、psmb9和psmb10；转录激活因子基因包括nlrc5和irf1；干扰素应答基因包括stat1、gbp2、isg15和ifit3。即抗原呈递转化基因组总计包括18个基因。

19、当检测对象为人时，抗原呈递转化基因组包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、b2m、tap1、tap2、tapbp、tapbpl、psmb8、psmb9、psmb10、nlrc5、irf1、stat1、gbp1、gbp2、isg15与ifit3。

20、需要说明的是，以上18个基因是小鼠的主要组织相容性复合体i类分子基因、抗原加工转运基因、免疫蛋白酶体基因、转录激活因子基因、干扰素应答基因；在检测对象为其它物种时，需要将这些基因按同源关系映射为相应物种的基因。例如，将以上抗原呈递转化基因组按同源关系映射为人基因时，抗原呈递转化基因组包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、b2m、tap1、tap2、tapbp、tapbpl、psmb8、psmb9、psmb10、nlrc5、irf1、stat1、gbp1、gbp2、isg15与ifit3。

21、本技术中，同源映射基于权威数据库的同源关系，包括但不限于美国国立卫生研究院维护的homologene、ensembl compara、ncbi orthologs等公开资源；跨物种应用时按一对一或一对多同源关系逐一确定各模块对应基因，不作主观取舍；例如将本技术18基因按同源映射为人基因时，包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、b2m、tap1、tap2、tapbp、tapbpl、psmb8、psmb9、psmb10、nlrc5、irf1、stat1、gbp1、gbp2、isg15与ifit3共20个基因。

22、本技术的一种实现方式中，抗原呈递转化评分按照下式计算，对于目标细胞群中的细胞i及基因j，其标准化得分为基因j在细胞i中的表达值减去基因j在参考细胞群中的表达均值后除以基因j在参考细胞群中的表达标准差；抗原呈递转化评分为细胞i在抗原呈递转化基因组内全部基因的标准化得分的算术平均值。

23、本技术的一种实现方式中，分子状态分型判断步骤的预先确定的阈值为，在参考数据集上，使抗原呈递转化评分对第一免疫状态移植物组与第二免疫状态移植物组两类细胞的区分约登指数最大的评分取值。

24、本技术的一种实现方式中，目标细胞群为胰岛细胞、内皮细胞、髓系细胞和间质细胞中的一种或多种，且不包括淋巴细胞。

25、本技术还公开了一种分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的装置，包括归一化表达矩阵分析模块、确认抗原呈递转化基因组模块、抗原呈递转化评分模块、分子状态分型判断模块、排斥相关分子状态指数计算模块和输出模块；

26、归一化表达矩阵分析模块，包括用于获取基于移植物组织产生的单细胞转录组表达数据，对其进行质量控制和对数归一化，得到归一化表达矩阵；

27、确认抗原呈递转化基因组模块，包括用于从归一化表达矩阵中确定抗原呈递转化基因组，抗原呈递转化基因组包括主要组织相容性复合体i类分子基因、抗原加工转运基因、免疫蛋白酶体基因、转录激活因子基因和干扰素应答基因；

28、抗原呈递转化评分模块，包括用于对抗原呈递转化基因组中的每个基因，以该基因在参考细胞群中表达值的均值和标准差，将目标细胞群中各细胞该基因的表达值减去均值再除以标准差，得到标准化得分，并对同一细胞在抗原呈递转化基因组内各基因的标准化得分以相同权重求算术平均，得到该细胞的抗原呈递转化评分；目标细胞群为所述移植物内指定的一种或多种细胞类型；参考细胞群为参考数据集中对应目标细胞类型的细胞集合，参考数据集包含第一免疫状态移植物组与第二免疫状态移植物组，第一免疫状态移植物组与第二免疫状态移植物组为同种异体移植物与同系移植物的组合、或者排斥移植物与非排斥移植物的组合、或者活动性排斥移植物与耐受移植物的组合；

29、分子状态分型判断模块，包括用于在独立于待分型数据的参考数据集上预先确定的阈值，将目标细胞群中的各细胞划分为抗原呈递激活状态或静默状态，得到分子状态分型；

30、排斥相关分子状态指数计算模块，包括用于将处于抗原呈递激活状态的细胞数除以目标细胞群中通过质量控制的细胞总数，得到抗原呈递激活细胞比例，作为移植物的排斥相关分子状态指数；

31、输出模块，包括用于输出分子状态分型和排斥相关分子状态指数，作为移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的量化结果。

32、需要说明的是，本技术分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的装置，实际上就是通过各模块分别实现本技术的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法；因此，各模块的具体限定可以参考本技术的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法。例如，抗原呈递转化基因组的具体基因、抗原呈递转化评分计算方式、阈值的确定方式、目标细胞群等，都可以参考本技术的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法，在此不累述。

33、本技术还公开了一种分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的装置，该装置包括存储器和处理器；其中，存储器，用于存储程序；处理器，用于通过执行存储器存储的程序以实现本技术的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法。

34、本技术还公开了一种计算机可读存储介质，其包括程序，该程序能够被处理器执行以实现本技术的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法。

35、本技术还公开了一种用于移植物排斥相关分子状态量化与分型的检测试剂盒，其包括用于检测本技术的分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法中的抗原呈递转化基因组中各基因表达水平的试剂；该试剂包括特异性扩增引物、杂交探针或杂交芯片中的一种或多种，用于对待测样本中各基因的mrna或cdna进行体外特异性扩增、杂交捕获或芯片杂交检测。

36、本技术的一种实现方式中，本技术的试剂盒进一步还包括使用说明书，使用说明书记录有抗原呈递转化评分计算规则与预先确定的阈值。

37、本技术还提供了抗原呈递转化基因组在制备用于移植物排斥相关分子状态量化与分型的检测试剂盒中的应用，其中抗原呈递转化基因组包括主要组织相容性复合体i类分子基因、抗原加工转运基因、免疫蛋白酶体基因、转录激活因子基因和干扰素应答基因；当检测对象为小鼠时，主要组织相容性复合体i类分子基因包括b2m、h2-k1、h2-d1、h2-q7和h2-t23，抗原加工转运基因包括tap1、tap2、tapbp和tapbpl，免疫蛋白酶体基因包括psmb8、psmb9和psmb10，转录激活因子基因包括nlrc5和irf1，干扰素应答基因包括stat1、gbp2、isg15和ifit3；当检测对象为人时，抗原呈递转化基因组包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、b2m、tap1、tap2、tapbp、tapbpl、psmb8、psmb9、psmb10、nlrc5、irf1、stat1、gbp1、gbp2、isg15与ifit3。

38、需要说明的是，本技术创造性的将以上基因的组合用于分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态，结合本技术的方法和装置，能够将胰岛移植物排斥相关的抗原呈递样转化这一分子状态转化为可复现、可跨样本比较的连续评分与离散分型，并给出移植物层面的量化表征。

39、由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：

40、本技术分析移植物细胞抗原呈递相关免疫活化分子状态的方法，通过固定的抗原呈递转化基因组组合、抗原呈递转化评分和预先确定的阈值，将定性的抗原呈递样转化转变为可复现、可跨样本比较的连续评分与离散分型，使不同样本、不同批次的结果可直接比较。