基于花型花色遗传信息的芍药优良品种筛选方法与流程

本发明属于中药材选育，具体涉及基于花型花色遗传信息的芍药优良品种筛选方法。

背景技术：

1、白芍为毛茛科植物芍药（paeonia lactiflora pall）根的加工品，是我国常用的大宗中药材，具有养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳的功效；近年来，由于白芍市场需求量大、栽培面积迅速扩大，四川本地种源已无法满足生产需求，大量从安徽、浙江等外省引种栽培；四川本地品种为重瓣花类型，而安徽、浙江等地品种多为单瓣花类型，导致四川省内栽培的药用芍药呈现多种花型花色品种混杂的状态，药材质量参差不齐。

2、现有研究已对不同品种芍药的代谢产物差异进行了初步探索，表明不同品种芍药之间存在化学成分差异。然而，目前对不同花型花色药用芍药的系统分类研究不足，尚未建立基于花型花色特征的品种评价体系，更缺乏将花型花色遗传信息与药材质量、产量及药效作用相关联的筛选方法。

3、目前，中药材优良品种的筛选主要依赖于传统的表型观察、化学成分含量测定等方法，存在以下不足：

4、缺乏遗传信息指导：现有筛选方法多基于表型性状或化学成分的单指标评价，未将品种的遗传稳定性、亲缘关系等遗传信息纳入评价体系，难以从分子水平揭示品种差异的本质原因，也无法为后续分子育种、杂交育种提供遗传学依据。

5、评价指标单一：现有技术通常仅关注药材的某一类指标（化学成分含量或产量），未综合考虑遗传稳定性、药材质量、产量及药效作用等多维度指标，难以全面评价品种的优劣。

6、未建立花型花色与品质的关联：药用芍药的花型花色是其最直观、最易识别的表型特征，但现有技术尚未建立花型花色与药材遗传信息、质量、产量及药效之间的系统关联，无法利用花型花色这一简便特征指导优良品种的快速筛选。

7、针对现有技术存在的问题，我们提出了基于花型花色遗传信息的芍药优良品种筛选方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供基于花型花色遗传信息的芍药优良品种筛选方法。

2、本发明是这样实现的，基于花型花色遗传信息的芍药优良品种筛选方法，所述基于花型花色遗传信息的芍药优良品种筛选方法包括：

3、s10，在芍药盛花期，按花型将芍药划分为重瓣花和单瓣花两种类型并标记花型，按花瓣颜色进行花色划分并标记花色；对标记后的不同花型花色芍药植株，分别采集叶片和花瓣组织作为检测样品；

4、其中，所述花色划分为：重瓣白色、重瓣深紫粉色、重瓣淡紫粉色、单瓣深紫粉色、单瓣鲜紫红色、单瓣紫粉色、单瓣浅紫粉色、单瓣白色；

5、s20，获取不同花型花色芍药的完整叶片和花瓣组织，分别提取芍药的基因组dna和总rna，基于提取得到的基因组dna和总rna，对进行芍药多维度遗传信息分析，建立基于花型花色表型的遗传指纹图谱；

6、s30，以遗传指纹图谱为先验，对至少一组目标品种单株进行多维度质量评价，其中，所述多维度质量评价包括药效作用评价、产量评价、药材质量评价，得到目标品种单株的多维度评价结果；

7、s40，获取目标品种单株的多维度评价结果，结合花型花色、多维度评价结果、遗传指纹图谱的模态关联矩阵，基于模态关联矩阵构建回归筛选模型，计算目标品种的综合贴近评分值，筛选得到优良品种。

8、优选地，所述对进行芍药多维度遗传信息分析，包括：

9、基于芍药基因组dna，对不同花型花色芍药进行核基因组多态性分析，得到不同花型花色芍药的遗传距离、snp指纹图谱、叶绿体全基因组序列，并生成核基因组多态性分析结果；

10、基于芍药总rna，对不同花型花色芍药进行转录组差异表达分析，得到遗传信息差异性结果，基于遗传信息差异性结果筛选得到与花型发育相关的差异表达基因及与花色形成相关的结构基因和转录因子；

11、结合核基因组多态性分析结果、关键表达基因构建基于花型花色表型的遗传指纹图谱。

12、优选地，所述对不同花型花色芍药进行核基因组多态性分析，包括：

13、采用pcr扩增核糖体dna的内转录间隔区序列，得到its扩增序列，对its扩增序列进行sanger测序，将测序结果与genbank数据库比对，计算不同花型花色类型芍药的遗传距离；

14、基于芍药基因组dna，设计并合成芍药特异性ssr引物对，对不同花型花色类型芍药基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增产物经毛细管电泳分离后进行str分型，利用等位基因片段长度多态性数据构建各花型花色类型的微卫星指纹图谱，采用nei遗传相似系数法计算遗传相似系数，结合遗传相似系数计算不同花型花色类型芍药的遗传相似系数矩阵，采用upgma法构建遗传聚类树，结合遗传相似系数矩阵和聚类结果，识别遗传背景相近的花型花色类型分组，判定花型花色类型分组的遗传边界；

15、以花型花色类型分组的遗传边界为前验约束，基于遗传边界确定不同花型花色类型的相近分组和远缘分组，对于相近分组，筛选组内固定差异snp，对于远缘分组，筛选组内保守共有snp；

16、预构建paired-end测序文库，基于简化基因组测序数据挖掘候选snp位点，得到靶向snp标记集合；

17、对靶向snp标记集合进行snp分型验证，基于snp分型结果构建snp指纹图谱，并采用nei遗传距离法计算遗传距离矩阵；

18、基于基因组dna构建叶绿体基因组图谱，结合叶绿体基因组图谱提取不同花型花色类型叶绿体基因组的结构变异特征。

19、优选地，所述对不同花型花色芍药进行转录组差异表达分析，包括：

20、采用植物总rna提取试剂盒提取芍药总rna，将芍药总rna转录为cdna，基于cdna构建illumina标准cdna文库，对illumina标准cdna文库进行测序，得到高质量测序读长；

21、将高质量测序读长比对至芍药参考基因组，并进行转录本组装和表达量定量，得到参考基因表达量，结合参考基因表达量进行差异表达分析，得到差异表达值，以差异表达阈值筛选得到差异表达基因，并对芍药植株的差异表达基因进行功能注释和通路富集分析；

22、基于差异表达基因的功能注释和通路富集分析，筛选与雄蕊瓣化关联的差异表达基因，并筛选与花色形成关联的结构基因和转录因子，得到筛选后的关键表达基因。

23、优选地，基于遗传信息差异性结果筛选得到与花型发育相关的差异表达基因包括agamous基因和agl9基因；与花色形成相关的结构基因包括黄酮醇合酶和查耳酮合酶基因chs；与花色形成相关的转录因子包括r2r3-myb转录因子、spl9转录因子。

24、优选地，所述结合核基因组多态性分析结果、关键表达基因构建基于花型花色表型的遗传指纹图谱，包括：

25、获取核基因组多态性分析结果，识别核基因组多态性分析结果中不同花型花色芍药的遗传距离、snp指纹图谱、叶绿体基因组的结构变异特征，并获取关键表达基因的qrt-pcr表达量数据，对核基因组多态性分析结果、关键表达基因的qrt-pcr表达量数据标准化处理；得到标准化的多维度遗传数据；

26、采用分层加权整合策略，对多维度遗传数据分布赋权，将赋权后的多维度遗传数据按权重线性融合，得到综合遗传距离矩阵；

27、基于综合遗传距离矩阵，采用upgma法进行层次聚类，构建得到不同花型花色类型的遗传聚类树，在遗传聚类树上标注分子标识组合，并输出以花型花色类型为索引单元的基于花型花色表型的遗传指纹图谱。

28、优选地，所述多维度质量评价包括药效作用评价、产量评价、药材质量评价，得到目标品种单株的多维度评价结果；

29、对至少一组目标品种单株进行多维度质量评价的方法，包括：

30、以遗传指纹图谱为先验依据，从判定为遗传背景稳定一致各花型花色类型中，选取具有花型花色特征的目标品种单株；所述代表性花型花色特征包括：花型为重瓣花或单瓣花，且植株生长状态正常、无病虫害；每种花型花色类型选取的目标品种单株数量不少于20株，并记录各单株的遗传指纹图谱索引编号；

31、对目标品种单株进行产量评价，得到目标品种单株的产量评价值；

32、对目标品种单株进行药材质量评价，得到药材质量评价综合值，对目标品种单株进行药材质量评价时，采用高光谱分析、uplc-ms化学成分鉴定、desi-msi质谱成像分析、uplc多成分含量测定、qnmr总苷含量测定，将测定结果归一化后，采用灰色关联度分析法计算目标品种单株与理想优质药材参考序列的关联度，并以关联度作为药材质量评价综合值；

33、检测目标品种单株的关键表达基因表达量，并采用uplc-ms化学成分鉴定法检测五没食子酰葡萄糖、芍药酮苷、羟基芍药苷含量，得到药效成分总量，对关键表达基因表达量、药效成分总量正向归一化，采用熵权法确定关键表达基因表达量、药效成分总量权重，得到药效成分综合值；

34、将目标品种单株的产量评价值、药材质量评价综合值、药效成分综合值整合为多维度质量评价结果，并基于目标品种单株的遗传指纹图谱索引编号进行关联存储。

35、优选地，对目标品种单株进行产量评价时，产品评价为地上部分性状测定指标、地下部分产量指标，综合地上部分性状测定指标、地下部分产量指标，采用熵权法确定单项指标的权重，得到目标品种单株的产量评价值；地上部分性状测定指标包括茎高、叶片数、花朵数及单瓣花类型的果实数；地下部分产量指标包括根系鲜重和干重、主根数、根幅、芽头数、最长主根根长及最粗主根直径。

36、优选地，所述计算目标品种的综合贴近评分值，包括：

37、以目标品种单株的花型花色为行维度，以目标品种单株的多维度评价结果为列维度，并结合遗传指纹图谱的分子标识组合为深度维度，构建表征目标品种单株优良度的三阶数据张量；

38、采用高阶奇异值分解法对三阶数据张量进行降维分解，得到三阶数据张量的核心张量和三组模态关联矩阵，即花型花色-评价指标矩阵、花型花色-遗传信息矩阵、评价指标-遗传信息矩阵；提取模态关联矩阵对应的因子矩阵，基于hosvd算法求解因子矩阵，保留累积方差贡献率≥85％的前r个主成分，基于核心张量的元素值，识别花型花色类型、评价指标与遗传信息三个模态之间的协同关联模式，当核心张量的元素值大于预设显著性阈值（0.2）时，判定花型花色类型、评价指标与遗传信息存在显著协同关联，记录显著关联三元组；

39、预构建理想优质品种参考序列，采用熵权-topsis法计算目标品种单株与理想参考序列的综合贴近评分值，以目标品种单株与理想参考序列的综合贴近评分值为因变量，以花型花色类型主成分得分、因子矩阵中提取的评价指标主成分得分以及分子标识维度的量化编码值为自变量，构建多元非线性回归筛选模型；

40、

41、其中，分别表示第i个目标品种单株与理想参考序列的综合贴近评分值、综合贴近度的基础预测值，表示回归系数、第m个原始自变量（花型花色类型主成分得分、因子矩阵中提取的评价指标主成分得分以及分子标识维度的量化编码值），表示随机误差项，表示非线性转换函数；

42、采用最小二乘法估计回归系数，并进行显著性检验；当模型的调整判定系数≥0.80且检验显著<0.01时，判定回归筛选模型拟合有效；

43、将目标品种的多维度评价结果代入拟合有效的回归筛选模型，计算预测综合贴近评分值，按综合贴近评分值从高到低排序，选取排名前3的花型花色类型作为优良品种候选；对优良品种候选类型内的全部目标品种单株，按综合贴近评分值排序，选取排名前30％的个体作为核心繁育材料，完成优良品种筛选。

44、优选地，预构建理想优质品种参考序列时，对每个花型花色类型，选取该花型花色类型内显著关联三元组中产量评价值、药材质量评价综合值、药效成分综合值均处于前10％分位数的显著关联个体，并以显著关联个体多维度评价结果的均值作为花型花色类型的理想参考值，同时提取花型花色类型的共有分子标识特征作为理想遗传标识，结合理想参考值、理想遗传标识构建理想优质品种参考序列。

45、与现有技术相比，本技术实施例主要有以下有益效果：

46、本发明通过its、ssr、snp、叶绿体全基因组和转录组多维分子标记，系统解析重瓣/单瓣及不同花色的遗传背景，有效剔除混杂个体；且以遗传指纹图谱为筛选前提，对入选单株开展产量、药材质量及药效的多维度立体评价；并利用高阶张量分解与熵权-topsis方法，将花色表型、分子数据与品质指标深度融合，量化评估各单株的综合贴近度，从而精准定位高产、高质、强效的优良品种；从而将传统依赖经验的选种转化为基于多源数据融合的量化筛选，缩短了育种周期，并实现个体水平的精准鉴定，为药用芍药良种繁育提供了可靠的技术支撑。

47、本发明实施例中，通过整合its序列分析、ssr微卫星标记、snp靶向筛选、叶绿体全基因组测序及转录组差异表达分析等多维分子标记技术，解析了重瓣/单瓣及不同花色药用芍药的遗传背景，并构建了包含核基因序列多态性、叶绿体基因组结构变异及功能基因表达差异的综合性遗传指纹图谱；遗传指纹图谱采用bootstrap重抽样评估分支支持率，以≥90%的阈值判定遗传背景稳定一致的独立品种或品系，有效识别并排除了种源混杂个体，从而解决了传统表型观察无法区分遗传稳定性与杂交混杂的技术瓶颈，为后续以遗传信息为指导的精准筛选提供了可靠的分子水平先验依据。

48、本发明以遗传指纹图谱为筛选前提约束，对经遗传背景验证的目标品种单株同步开展产量评价、药材质量评价和药效作用评价的三维立体评价，其中产量评价涵盖地上农艺性状与地下根系产量的10项指标并采用熵权法客观赋权，药材质量评价融合高光谱分析、uplc-ms化学成分鉴定、desi-msi质谱成像、uplc多成分含量测定及qnmr总苷含量测定等并以灰色关联度分析量化关联，药效作用评价整合关键基因表达量与核心药效成分含量并采用熵权法综合；多维度评价体系突破了现有技术单一指标评价的局限，实现了从遗传稳定性判定、表型产量测定、化学成分定性定量、药效物质基础解析的全链条质量把控，确保了入选单株兼具高产、高质、强效的综合性状。

49、本发明将花型花色表型、多维度评价结果与遗传指纹图谱的分子标识构建为三阶数据张量，采用高阶奇异值分解（hosvd）提取模态关联矩阵并识别显著协同关联三元组，进而结合熵权-topsis法计算综合贴近评分值，构建以花型花色主成分得分、评价指标主成分得分及分子标识量化编码值为自变量的多元非线性回归筛选模型；回归筛选模型实现了从传统依赖经验的选种向基于多源数据融合的量化筛选转变，能够在全部目标品种单株中突破单一花型花色的类型局限进行跨类型个体水平精准筛选，筛选出的核心繁育材料涵盖多种花型花色类型且各具差异化优势维度，既缩短了育种周期，又为后续针对不同应用需求的定向繁育和杂交育种提供了多元化的优良种质资源。