基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物及疫苗制剂

本发明涉及生物医药与生物材料交叉，尤其是一种蛋白纳米管水凝胶在制备疫苗组合物或疫苗制剂中的应用，特别适用于一种基于蛋白纳米管水凝胶制备的尼帕病毒的亚单位疫苗。

背景技术：

1、尼帕病毒(nipah virus，niv)属于副黏病毒科亨尼帕病毒属，是一类单股负链rna病毒，自然宿主是狐蝠科的果蝠(pteropodidae family)，尼帕病毒可引发严重的人畜共患病，具有高致病性，可通过动物传人、人传人以及食用被污染的食物传播，尼帕病毒的病死率高达40％至75％，由于其高致死率、人际传播及缺乏特效治疗手段，被列为‌生物安全四级（bsl-4）病原体‌，并被世界卫生组织（who）列入优先研发的新兴传染病病原体清单。目前尚无获批上市的尼帕病毒疫苗或特异性抗病毒药物，现有疫苗研发聚焦病毒表面g（附着糖蛋白）、f（融合糖蛋白）作为抗原或药物靶点，包括腺病毒载体、mrna、亚单位等多条技术路线，疫苗研究过程还存在对bsl-4实验室依赖度高、研发成本高、研发周期长等技术困难。

2、病毒亚单位疫苗由病原体的特定蛋白或多糖组成，因不含完整病原体且成分明确，安全性较高，成为尼帕病毒疫苗研发的重要方向。尼帕病毒亚单位疫苗研发起点是靶点抗原的筛选，常以g和f的单用或联用为主，技术难点包括：主要在于递送系统设计、抗原构象的维持及其免疫原性优化，这些问题严重制约了尼帕病毒亚单位疫苗的免疫效果：1）抗原构象维持‌：g、f糖蛋白结构复杂，脱离脂质环境后容易错误折叠，难以维持稳定、正确构象，导致免疫原性弱，难以有效激活天然免疫；2）免疫应答局限性‌：与‌减毒活疫苗相比，亚单位疫苗难以诱导持久的、更高水平的抗体应答，且几乎无法有效激发细胞毒性t淋巴细胞（ctl）的免疫应答，这对于清除细胞内感染的尼帕病毒（niv）至关重要；3）佐剂系统挑战‌：铝佐剂（如明矾）应用广泛，但主要偏向th2型体液免疫，对th1型免疫和ctl应答效果差；新型佐剂（如as01、spy）虽能部分增强免疫，但面临成本高昂、储存条件苛刻、潜在副作用强等限制；4）黏膜免疫瓶颈‌：尼帕病毒自然感染途径以呼吸道为主，鼻喷或滴鼻等黏膜免疫途径可在病毒入侵的第一道防线建立“局部阻断”，但是目前尚无获批的专用黏膜佐剂，仅有寥寥几款（如聚磷腈纳米载体）尚处于临床前阶段。因此，开发高效递送和佐剂系统以提升尼帕病毒亚单位疫苗的免疫原性、延长应答时间、扩展免疫途径，是当前关键研究方向。

3、病毒样颗粒（virus-like particles，vlps）是由病毒一个或多个结构蛋白自组装形成的、不含病毒遗传物质的纳米颗粒，其尺寸与形态易于被抗原呈递细胞摄取，具有良好的免疫佐剂特性。ms2噬菌体作为一种病毒样颗粒（vlps）的模型载体，已被应用于疫苗开发和药物递送的平台：ms2 vlps表面有一个名为“ab loop”的区域，可以像“插槽”一样容纳外源的抗原片段，将其高密度地展示在颗粒表面，从而激发强烈的免疫反应，比如用于人乳头瘤病毒（hpv）、手足口病病毒、疟原虫、沙眼衣原体等病原体疫苗，作为一种具有免疫佐剂效应的展示平台，成功在小鼠模型中诱导了特异性免疫应答；ms2 vlps的内部空腔可以封装外源物质，比如已有临床前实验证明可以将外源rna序列（如作为内参的rna或具有治疗潜力的mrna）封装于ms2 vlps内部，可以保护rna不被降解。然而，传统ms2 vlps作为疫苗佐剂平台展示抗原或作为递送载体平台包装rna，通常是以其天然的二十面体形态存在。已有研究（“transformation of a viral capsid from nanocages to nanotubes and then tohydrogels redirected self-assembly and effects on immunogenicity”，mengsi yang等，acs nano 2024，18，13755−13767）提供了一种可编程、可调控、可逆的蛋白纳米材料平台：将ms2噬菌体衣壳蛋白（capsid protein，cp）的46和70位点分别定点突变为丙氨酸和半胱氨酸的双位点突变体（cpc46a/q70c），可以使其从球状vlps的纳米笼状转变为直径约7.2nm、长度约1 µm的纳米管状；在此基础上，将75位点也定点突变为半胱氨酸的三位点突变体（cpc46a/q70c/v75c），可以通过纳米管之间的二硫键交联形成粘弹性固体（viscoelasticsolid）状的纳米管水凝胶，分子动力学分析显示其具有典型水凝胶的流变特性，免疫原性结果显示该三位点突变体更倾向于激发细胞免疫反应。该研究揭示了通过基因工程定点突变可以获得ms2 cp多层级、可变形（纳米笼、纳米管、纳米管水凝胶）的自组装体系，且不同形态赋予其免疫原性显著差异。因此，相对于传统ms2 vlps的单一形态，将形态可控的突变体作为下一代蛋白亚单位疫苗（如尼帕病毒亚单位疫苗）的递送或佐剂平台，是一个极具前景的研发方向。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种蛋白纳米管水凝胶形态的疫苗佐剂或递送系统及其在尼帕病毒疫苗中的应用。

2、为达到上述目的，本发明还提供了蛋白纳米管水凝胶与尼帕病毒亚单位疫苗的制备方法。

3、第一方面，本发明提供了一种基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括蛋白纳米管水凝胶和特异性抗原，蛋白纳米管水凝胶为通过ms2噬菌体衣壳蛋白三位点突变体cpc46a/q70c/v75c的纳米管之间二硫键交联后自组装形成的三维网状结构的水凝胶，三位点突变体cpc46a/q70c/v75c具有如seq id no:1所示的氨基酸序列；特异性抗原为亚单位疫苗形式的抗原；蛋白纳米管水凝胶与特异性抗原通过物理混合形成复合物。

4、根据本发明的一个优选实施例，所述蛋白纳米管水凝胶英文简称为ss3（s-scrosslinked triple mutant）。

5、根据本发明的一个优选实施例，所述基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物中，特异性抗原为针对尼帕病毒的抗原，物理混合为将蛋白纳米管水凝胶与特异性抗原简单混匀，蛋白纳米管水凝胶的纯化与制备过程不需添加化学交联剂。

6、根据本发明的一个优选实施例，所述基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物中，特异性抗原为针对尼帕病毒的双抗原复合物，蛋白纳米管水凝胶的添加浓度为0.3～0.5 mg/ml。

7、优选地，所述基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物中，双抗原复合物选自尼帕病毒融合糖蛋白f的表位富集段和附着糖蛋白g的胞外域，其中融合糖蛋白f的表位富集段具有如seq id no:2所示的氨基酸序列，所述附着糖蛋白g的胞外域具有如seq id no:3所示的氨基酸序列。

8、第二方面，本发明提供了一种基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗制剂，包括第一方面所述的基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物，但是不包括其他疫苗佐剂。

9、根据本发明的一个优选实施例，所述基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗制剂为注射剂、滴鼻剂吸入剂或喷雾剂。

10、根据本发明的一个优选实施例，所述基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗制剂的免疫途径为皮下注射，蛋白纳米管水凝胶在皮下注射后于注射部位形成抗原库，将特异性抗原的体内清除半衰期延长至不少于4天。

11、优选地，免疫途径为皮下注射时，通过皮下注射的疫苗制剂的剂量为50 µl/只小鼠。

12、优选地，免疫途径为皮下注射时，蛋白纳米管水凝胶的含量不超过25 µg/只小鼠。

13、优选地，免疫途径为皮下注射时，单次免疫后就能够获得较高浓度和更持久作用的特异性igg抗体，配以加强免疫后能够获得更高浓度的特异性igg抗体。

14、根据本发明的一个优选实施例，所述基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗制剂的免疫途径为黏膜免疫时，黏膜免疫配以加强免疫后同时诱导激发体液免疫与细胞免疫。

15、优选地，免疫途径为黏膜免疫的具体免疫方式为滴鼻免疫，通过鼻腔滴加的疫苗制剂的剂量为10 µl/只小鼠。

16、优选地，免疫途径为黏膜免疫时，蛋白纳米管水凝胶的含量不超过5 µg/只小鼠。

17、优选地，免疫途径为黏膜免疫时，能够协同产生血清特异性igg抗体、血清iga抗体以及th1型细胞免疫应答。

18、第三方面，本发明提供一种疫苗递送平台，以第一方面所述的基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物、或者第二方面所述的基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗制剂为基础构建。

19、第四方面，本发明提供一种第一方面所述的基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗组合物，或者第二方面所述的基于蛋白纳米管水凝胶的疫苗制剂，或者第三方面所述的疫苗递送平台在病毒亚单位疫苗中的应用，该应用不仅适用于尼帕病毒抗原，还适用于其他传染病抗原、肿瘤抗原。

20、本发明的有益效果：

21、本发明涉及一种基于蛋白纳米管水凝胶（ss3）的疫苗组合物，及其在尼帕病毒亚单位疫苗中的应用。首先，蛋白纳米管水凝胶（ss3）可通过常规原核或真核表达系统制备，纯化方法简单且能获得较高纯度的产物，通过将蛋白纳米管水凝胶ss3与病毒抗原简单物理混匀，即可获得蛋白纳米管水凝胶免疫增效的病毒亚单位疫苗，本发明为开发一种兼具良好生物相容性、高效免疫激活能力的非化学合成材料的蛋白纳米管水凝胶（ss3），未来有可能是在病毒亚单位疫苗兼具有缓释递送效果的疫苗佐剂研发领域的重要研究和应用方向。

22、针对传统合成水凝胶存在的制备材料毒性残留、生物相容性较差、与抗原混合后递送与释放过程不可控等问题，本发明提供的蛋白纳米管水凝胶（ss3）属于一种完全由生物源性蛋白质构成的水凝胶系统，通过纳米管之间二硫键交联形成独特的三维网状结构的水凝胶，组成成分本质为蛋白质，具有良好的生物相容性和可生物降解性。同时因蛋白纳米管水凝胶（ss3）完全来源于噬菌体ms2衣壳蛋白的三位点突变体（cpc46a/q70c/v75c），不仅具有良好生物相容性，而且天然具有刺激免疫系统的优势，从根本上避免了传统合成佐剂或材料可能存在的安全隐患。

23、关于安全性，蛋白纳米管水凝胶（ss3）用于尼帕病毒亚单位疫苗的佐剂使用时，皮下免疫时最高注射剂量为25 µg，滴鼻免疫时最高剂量为5 µg，两种免疫方式下实验小鼠的精神状态、体重及体型与阴性对照组相比均无明显差异，显示出良好的安全性。

24、关于皮下免疫途径的优势，蛋白纳米管水凝胶（ss3）是通过纳米管之间的二硫键交联形成独特三维网状结构，皮下注射后能高效物理包裹抗原，形成局部“抗原库”，可被视为兼具有疫苗递送平台的作用，实验证明添加蛋白纳米管水凝胶（ss3）不仅能显著延缓抗原的体内清除，还能同时在仅单次皮下免疫小鼠后获得较高的抗原特异性抗体，进行加强免疫则能获得更高的血清特异性抗体滴度。活体成像实验证实，与游离抗原相比，添加蛋白纳米管水凝胶（ss3）后的荧光标记的抗原在注射部位荧光信号半衰期平均延长至少2天（从2天延长至4.3天），同时激发强大的体液免疫，产生与传统佐剂相似甚至略高的特异性抗体滴度，但无任何副作用，蛋白纳米管水凝胶（ss3）持续的抗原释放模式，为免疫系统持续活化提供长效刺激，是诱导强大持久免疫应答的物理基础。

25、关于黏膜免疫途径的优势，蛋白纳米管水凝胶（ss3）在具体的滴鼻免疫中应用，可同时激发强大体液免疫与细胞免疫，填补了尚无批复上市鼻喷疫苗佐剂的空白。混合该蛋白纳米管水凝胶（ss3）的病毒亚单位疫苗通过滴鼻免疫配以加强免疫后，在体液免疫方面，能诱导产生显著更高滴度的血清尼帕病毒抗原特异性igg与iga抗体；在细胞免疫方面，通过elispot检测能高效激活th1型t细胞应答。

26、本发明提供的含蛋白纳米管水凝胶（ss3）的疫苗递送平台具有广泛的通用性。蛋白纳米管水凝胶（ss3）本身无需与其他佐剂联用即可单独实现强效免疫增强，简化了疫苗配方，提高了工艺稳定性，并降低了多组分共存带来的复杂性和不可控风险。因此含蛋白纳米管水凝胶（ss3）的疫苗递送平台不仅适用于尼帕病毒融合糖蛋白f和附着糖蛋白g这样的双抗原复合物，同样预期可适用于其他传染病抗原、肿瘤抗原等，为开发新型高效的预防性疫苗和治疗性疫苗提供了全新的技术工具。

27、本发明提供的含蛋白纳米管水凝胶（ss3）的系统优势：蛋白纳米管水凝胶（ss3）系统同时具有疫苗缓释效果与免疫增效作用，蛋白纳米管水凝胶（ss3）完全由生物源性蛋白质构成，易生物降解，生物相容性好，因噬菌体来源天然具有刺激免疫系统优势，避免了传统合成佐剂或材料的安全隐患。蛋白纳米管水凝胶（ss3）无需与其他佐剂联用即可实现强效免疫增强，疫苗配方简化，工艺稳定性提高，复杂性和不可控风险降低，为开发新型高效“治疗性疫苗”和“预防性疫苗”提供全新技术工具。