一种基于质谱谱图证据的浓度依赖关系自动识别泛修饰蛋白位点的方法与流程

一、本发明涉及质谱数据分析、生物信息学、药物蛋白相互作用分析和蛋白共价加合位点识别，尤其涉及一种基于质谱谱图证据的浓度依赖关系自动识别泛修饰蛋白位点的方法。

背景技术：

0、二、背景技术

1、（一）现有技术状况

2、在药物蛋白相互作用研究、共价抑制剂筛选、外源小分子加合修饰研究以及药物作用机制探索中，研究人员常需要判断某一小分子是否与蛋白发生共价结合，并进一步确定其具体结合位点。常规流程通常包括：对质谱数据进行数据库搜索或开放搜索，筛选与候选加合质量相符的psm；再由分析人员逐条查看ms/ms谱图，判断是否存在跨修饰位点的关键碎片离子、修饰位点两侧的离子连续性以及前体质量误差等证据；随后结合空白组、低浓度组和高浓度组之间的出现情况或信号变化，决定是否将候选位点纳入后续prm靶向验证。

3、现有技术中，候选位点发现可采用预设加合质量的限制性数据库搜索，也可采用开放搜索后筛选目标质量偏移的方式。对于验证阶段，研究人员常借助skyline等软件建立prm或其他靶向采集方法，对候选肽段和特征碎片离子进行二次确认。上述方法在一定程度上能够发现候选共价结合位点，但从候选筛选到位点确认之间仍高度依赖人工审谱和经验判断。

4、（二）现有技术存在的问题

5、现有流程至少存在以下不足：第一，谱图证据判断标准不统一，不同分析人员对同一候选psm是否足够可信可能得出不同结论；第二，空白组、低浓度组和高浓度组之间的比较多依赖人工观察，缺少能够被复用和追溯的浓度依赖量化指标；第三，在低丰度样本、弱谱图、候选位点数量较多或加合质量复杂的情况下，人工复核成本较高，且容易遗漏重要候选位点；第四，候选psm搜索结果、谱图证据、浓度响应和后续prm验证建议之间缺少统一闭环，难以形成标准化的项目交付流程。

6、因此，亟需一种能够将谱图证据和样本浓度依赖关系联合建模的方法，对蛋白共价结合位点进行自动识别、证据打分、置信度分级和验证建议输出，从而提高共价结合位点发现的效率、一致性和可解释性。

技术实现思路

0、三、 技术实现要素：

1、（一）发明目的

2、本发明的目的在于提供一种基于质谱谱图证据的浓度依赖关系自动识别泛修饰蛋白位点的方法，用于解决现有共价位点发现流程中人工审谱依赖强、评分标准不统一、浓度响应缺少自动化量化、候选位点复核效率低以及验证建议输出不成体系的问题。

3、（二）技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供一种蛋白共价结合位点自动识别方法。该方法以质谱搜索结果、谱图峰表、样本分组信息和给药浓度信息为输入，通过候选psm初筛、谱图证据评分、浓度依赖评分、综合置信度分级和验证建议输出，实现从候选位点发现到prm前筛的自动化闭环。

5、具体地，所述方法包括以下步骤。

6、s1：数据获取。获取待分析样本的质谱搜索结果和原始谱图信息。所述样本至少包括空白组和一个或多个给药浓度组；所述质谱搜索结果至少包括候选肽段序列、候选修饰质量、候选修饰位点、psm得分、target/decoy标签和谱图峰表，也可以进一步包括前体质量误差、碎片离子质量误差、保留时间、峰面积或前体强度。

7、s2：候选psm初筛。根据输入的小分子理论质量、可能失去的基团、候选反应残基集合或预设加合质量窗口，对搜索结果进行初筛，得到候选共价加合psm集合。候选加合质量可以由小分子理论质量及反应过程中可能发生的脱氢、脱水、脱卤素、失去保护基等质量变化推导得到。

8、s3：谱图证据评分。对每个候选psm计算谱图证据分数。该分数可以包括跨修饰位点的b/y离子数量、跨位点关键离子的峰强度占比、修饰前后离子系列连续性、前体质量误差、碎片离子质量误差、同位素分布一致性、未修饰对应肽段的对照证据以及重复样本中的谱图一致性。

9、s4：浓度依赖评分。对每个候选位点计算浓度依赖分数。该分数可以包括候选位点在空白组中的缺失程度、在高浓度组中的出现频率、随浓度升高的谱图数增幅、峰面积或前体强度变化趋势、低浓度组与高浓度组之间的组间差异以及重复样本中的稳定性。

10、s5：综合置信度分级。将谱图证据分数与浓度依赖分数进行联合，形成候选位点综合置信度分数。联合方式可采用规则打分、加权求和、机器学习分类器、贝叶斯推断、专家系统或其组合方式。根据综合置信度分数，将候选位点划分为高可信、中可信和低可信。

11、s6：验证建议输出。对高可信和中可信候选自动生成后续验证建议，包括建议的prm优先靶肽、推荐监测离子、建议保留时间窗口、是否引入重标肽内标、是否需要扩展目标残基集合复搜以及是否需要在全库背景下复核。

12、进一步地，本发明可设置双搜索模式：先在目标蛋白限制数据库中提高候选发现灵敏度，再在全数据库背景下对候选位点进行复核，以平衡低丰度发现能力与假阳性控制。

13、进一步地，本发明可针对不同化学反应类型设置候选残基先验。例如，对于巯基亲和型小分子，提高半胱氨酸位点权重；对于亲核取代型或亲电加合型小分子，考虑赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等可能发生反应的残基，并允许用户根据实验设计动态调整候选残基集合。

14、（三）有益效果

15、第一，本发明将人工审谱中常用的跨修饰位点关键碎片离子、离子系列连续性、质量误差等经验标准转化为可计算指标，降低不同分析人员之间的主观差异。

16、第二，本发明将空白组、低浓度组和高浓度组之间的浓度响应信息纳入位点可信度评分，能够增强对真实药物加合位点的识别能力，降低偶然匹配或背景噪声造成的伪阳性。

17、第三，本发明形成了从候选psm初筛、谱图证据评分、浓度依赖评分、置信度分级到prm验证建议输出的一体化流程，可减少人工复核负担，提高项目交付效率。

18、第四，本发明既适用于科研场景中的药物作用机制探索，也适用于企业研发中的候选药物共价结合评估，具有较高的应用价值和可复用性。

1.一种基于质谱谱图证据的浓度依赖关系自动识别泛修饰蛋白位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取待分析样本的质谱搜索结果和原始谱图信息，其中所述待分析样本至少包括空白组和一个或多个给药浓度组；根据输入的小分子理论质量、候选反应残基集合和/或预设加合质量窗口，从所述质谱搜索结果中筛选候选共价加合psm集合；对所述候选共价加合psm集合中的每个候选psm计算谱图证据分数；对同一候选修饰位点在不同样本或不同浓度组中的出现情况和信号变化计算浓度依赖分数；将所述谱图证据分数与所述浓度依赖分数联合，得到候选修饰位点的综合置信度分数；根据所述综合置信度分数对候选修饰位点进行分级，并输出蛋白共价结合位点识别结果和验证建议。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱搜索结果包括候选肽段序列、候选修饰质量、候选修饰位点、psm得分、target/decoy标签、前体质量误差、保留时间、峰面积或前体强度中的一种或多种；所述原始谱图信息包括ms/ms谱图峰表或由原始质谱数据转换得到的峰列表。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选候选共价加合psm集合的步骤包括：根据小分子理论质量以及可能发生的脱氢、脱水、脱卤素、失去保护基或其他反应质量变化，生成一个或多个候选加合质量；将所述候选加合质量与质谱搜索结果中的候选修饰质量进行匹配；并根据候选反应残基集合对候选psm进行保留或降权。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谱图证据分数包括以下指标中的一种或多种：跨修饰位点的b离子或y离子数量、跨修饰位点关键碎片离子的峰强度占比、修饰位点两侧离子系列连续性、前体质量误差、碎片离子质量误差、同位素分布一致性、未修饰对应肽段的对照证据、以及同一候选位点在重复样本中的谱图一致性。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓度依赖分数包括以下指标中的一种或多种：候选位点在空白组中的缺失程度、在给药组中的出现频率、随给药浓度升高的谱图数增幅、峰面积或前体强度随给药浓度升高的变化趋势、低浓度组与高浓度组之间的组间差异、以及候选位点在生物学重复或技术重复中的稳定性。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述综合置信度分数通过规则打分、加权求和、机器学习分类器、贝叶斯推断、专家系统或其组合方式得到，其中谱图证据分数和浓度依赖分数分别作为独立证据来源参与综合评分。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分级包括将候选修饰位点划分为高可信候选、中可信候选和低可信候选；其中高可信候选输出为优先确认位点，中可信候选输出为建议人工复核位点，低可信候选予以降级、标记或剔除。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述验证建议包括prm优先靶肽、推荐监测碎片离子、建议保留时间窗口、是否引入重标肽内标、是否扩展候选反应残基集合复搜、以及是否采用全库背景复核中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括双搜索模式：先在目标蛋白限制数据库中进行候选发现，以提高低丰度候选共价位点的发现灵敏度；再在全数据库背景下对候选位点进行复核，以降低偶然匹配或背景噪声导致的假阳性。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选反应残基集合根据小分子的化学反应类型动态确定；对于巯基亲和型小分子，提高半胱氨酸位点权重；对于亲核取代型或亲电加合型小分子，考虑赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或其他具有潜在反应性的氨基酸残基。