一种负载miR-210@ZIF-8的应力松弛水凝胶心脏补片、制备方法及应用

本发明涉及生物材料与组织工程领域，具体而言，涉及一种负载mir-210@zif-8的应力松弛水凝胶心脏补片、制备方法及应用。

背景技术：

1、心肌梗死发生后，心肌组织持续处于缺血缺氧状态，引发心肌基质纤维化重构，导致基质刚度异常升高与应力耗散能力显著降低。这种异常硬化的机械微环境持续作用于心肌细胞，刺激drp1（动力蛋白相关蛋白1）蛋白表达上调，诱导线粒体过度分裂与碎片化，造成心肌细胞不可逆损伤；同时，缺血缺氧微环境直接破坏心肌细胞线粒体膜电位稳定性，阻碍atp（三磷酸腺苷）合成过程，引发能量代谢紊乱，进一步加剧心肌细胞凋亡、心室壁进行性变薄及心肌纤维化进程，成为心肌梗死后心功能持续恶化与心力衰竭发生的核心病理基础。因此，实现对梗死心肌区域异常力学微环境与缺氧代谢障碍的双重协同干预，是突破当前心肌修复技术瓶颈的关键所在。

2、在现有心肌组织工程研究中，水凝胶心脏补片作为重要修复策略已被广泛应用，但技术体系主要分为机械支撑型与单一药物递送型两类，均存在显著局限性。机械支撑型水凝胶普遍采用单一、稳定的共价交联网络结构，其力学特性刚性强，缺乏动态响应能力，仅能提供被动静态支撑作用。此类水凝胶无法实现可控的应力松弛与应力耗散功能，难以有效消解心肌梗死后硬化基质产生的持续性异常机械刺激，因而无法从源头抑制机械应力诱导的线粒体过度分裂现象，导致力学修复模式单一，与动态变化的心肌微环境适配性差，修复效果受到根本性制约。

3、针对心肌缺氧代谢损伤，现有技术尝试通过递送mir210(微小rna-210)分子调控心肌细胞缺氧适应能力与线粒体功能，但游离mir-210在体内稳定性极低，极易被组织核酸酶快速降解，且细胞摄取效率低下，常滞留于细胞内体或溶酶体中，难以释放至胞质发挥生物学功能。虽然zif-8（沸石咪唑酯骨架-8）纳米载体负载mir-210可提供核酸保护作用并提升胞内递送效率，实现酸性微环境响应释药，但此类体系仅专注于改善心肌细胞代谢功能，完全忽视了对梗死区域异常力学微环境的调控，无法解决机械应力介导的心肌损伤问题，存在修复机制片面化、无法协同干预双重病理缺陷的严重不足。

4、在成型工艺方面，传统模具成型方法难以精确调控心脏补片的外形轮廓、厚度分布及内部孔隙结构，导致产品均一性差，个体适配性低，无法满足临床个体化修复需求。数字光处理3d打印技术虽能实现材料高精度结构化成型，但现有复合复合水凝胶基质在同时兼顾打印成型稳定性、动态应力松弛力学性能、纳米活性因子均匀负载及响应释药等多重性能方面面临巨大挑战，至今尚未开发出能够整合力学微环境调控、线粒体代谢调控及高精度可控成型的一体化心肌修复补片体系。

5、综上，当前心脏补片技术普遍存在修复机制单一、性能与微环境适配性差、成型精度不足等技术瓶颈，无法有效协同调控心肌梗死后异常机械微环境刺激与缺氧线粒体代谢障碍这两大核心病理因素，导致心肌修复效果有限，抗纤维化能力不足，严重制约了心肌梗死修复的临床转化应用。

6、针对上述问题，现有技术亟需改进。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种负载mir-210@zif-8的应力松弛水凝胶心脏补片、复合可打印水凝胶质生物墨水，能够协同调控心肌梗死后异常力学微环境与缺氧代谢障碍，有效抑制线粒体过度分裂，显著提升心肌修复效果和抗纤维化能力。mir210@zif-8即zif-8负载的微小rna-210纳米颗粒。

2、本发明的上述目的一种负载mir-210@zif-8的应力松弛水凝胶心脏补片具体由水凝胶质生物墨水经3d打印形成，所述水凝胶质生物墨水包括复合水凝胶基质和mir-210@zif-8纳米颗粒，mir-210@zif-8纳米颗粒均匀分布于复合水凝胶基质内部。

3、复合水凝胶基质设置为双交联网络结构复合水凝胶基质，双交联网络结构复合水凝胶基质包含有交联稳定网络与动态交联网络，交联稳定网络设置为用于维持心脏补片整体结构与尺寸稳定性的可光交联高分子聚合形成，动态交联网络由含醛基多糖与含氨基蛋白质通过动态席夫碱键构筑。可光交联高分子设置为甲基丙烯酰化透明质酸，上述mir-210@zif-8纳米颗粒均匀分布于甲基丙烯酰化透明质酸；含醛基多糖为氧化葡聚糖，含氨基蛋白质为明胶；

4、优选的，上述复合水凝胶基质还包含光引发剂lap。lap是指：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。

5、mir-210@zif-8纳米颗粒设置为锌离子与2-甲基咪唑配位自组装形成的规则多面体颗粒，粒径分布区间为140～220nm，表面电位为-13mv±2mv。

6、优选的，上述mir-210@zif-8纳米颗粒设置有mir-210和zif-8纳米颗粒，mir-210包覆于zif-8纳米颗粒；zif-8纳米颗粒均匀分布于所述甲基丙烯酰化透明质酸。

7、本发明的另一目的在于提供了上述技术所记载的一种负载mir-210@zif-8的应力松弛水凝胶心脏补片的制备方法，包括以下步骤：

8、s1、分别制备甲基丙烯酰化透明质酸、氧化葡聚糖及mir-210@zif-8纳米颗粒，并使用去离子水分别配置为浓度为5%w/v甲基丙烯酰化透明质酸溶液、浓度为10%w/v的氧化葡聚糖溶液。

9、s2、制备无菌可打印水凝胶质生物墨水：采用分步投料工艺，将mir-210@zif-8纳米颗粒均匀分散于甲基丙烯酰化透明质酸溶液中获得预溶溶液1；在恒温摄氏度t1条件下往预溶溶液1加入明胶溶液混匀得到预溶溶液2；在避光条件下往预溶溶液2加入光引发剂溶液搅拌混匀得到预溶溶液3；最后往预溶溶液3快速加入氧化葡聚糖溶液混匀获得水凝胶质生物墨水；

10、s3、数字光处理3d打印成型：采用数字光处理3d打印设备对水凝胶质生物墨水进行逐层光固化3d打印成型，成型后经无菌去离子水洗涤去除未交联杂质，得到应力松弛水凝胶心脏补片。

11、具体的，上述步骤s1中甲基丙烯酰化透明质酸的制备方法具体为：

12、s1a-1，将透明质酸钠溶解于去离子水中制备成质量体积浓度为1%的透明质酸溶液；

13、s1a-2，将透明质酸溶液进行冰浴搅拌调节ph数值至ph8.0～ph9.0后，在反应时间s内滴加甲基丙烯酸酐，滴加完成后，于4℃条件下继续反应24h，使透明质酸分子链上的羟基与甲基丙烯酸酐发生酯化反应产生引入可光交联的甲基丙烯酰基反应液；

14、s1a-3，将甲基丙烯酰基反应液加入氯化钠，使氯化钠终浓度达到0.5mol/l后终止反应获得终止反应混合溶液；将终止反应混合溶液缓慢加入5倍体积的预冷无水乙醇中，充分搅拌后静置30min，使甲基丙烯酰化透明质酸析出后采用5000×g离心5min收集沉淀，并使用预冷无水乙醇洗涤两次获得初步沉淀酸物；

15、s1a-4，将初步沉淀酸物重新溶解于去离子水中，通过透析袋1进行透析处理获得初步透析酸物质，将初步透析酸物质进行-80℃预冻后进行冷冻干燥获得白色海绵状的甲基丙烯酰化透明质酸。

16、具体的，上述步骤s1中氧化葡聚糖的制备方法具体为：

17、s1b-1，分别制备质量体积浓度100g/l葡聚糖溶液和质量体积浓度100g/l高碘酸钠溶液；

18、s1b-2，在避光条件下，将高碘酸钠溶液缓慢滴加至葡聚糖溶液，室温反应4h，获得初步醛基反应溶液；

19、s1b-3，将初步醛基反应溶液加入对应15分之一体积的乙二醇溶液，进行终止搅拌氧化反应操作后获得初含氧化葡聚糖粉初溶液，将所述初含氧化葡聚糖粉初溶液装入透析袋2进行透析处理，完成后获得透析完成浓缩液，将透析完成浓缩液于-80℃预冻并冷冻干燥，得到呈现粉末状的氧化葡聚糖粉末。

20、高碘酸钠溶液缓慢滴加至葡聚糖溶液中高碘酸钠与葡聚糖设置为1:7.6w/w-1:3.8w/w；

21、具体的，上述步骤s1中mir-210@zif-8纳米颗粒的制备方法具体为：

22、s1c-1，使用经焦碳酸二乙酯处理的水分别配制40mmol/l醋酸锌溶液和1.28mol/l2-甲基咪唑溶液。

23、s1c-2，按照体积比算，取10倍体积的浓度为40mmol/l的醋酸锌溶液，加入1倍体积的浓度为20μmol/l的mir-210溶液，轻柔混合后于室温孵育10min，形成使zn2+与mir-210带负电的磷酸骨架发生静电相互作用并形成成核位点的混合液。

24、s1c-3，在快速搅拌条件下，向混合液中迅速加入1倍体积的浓度为1.28mol/l的2-甲基咪唑溶液形成c-3反应液。醋酸锌与2-甲基咪唑的摩尔比为1∶32。

25、等待c-3反应液出现表明zif-8配位结构开始形成的浑浊现象时将c-3反应液于室温静置反应20min，形成使mir-210在zif-8形成过程中被同步包载的初步包载纳米液。

26、s1c-4，将反应完成后获得的初步包载纳米液，逐步通过以12000rpm离心15min，弃去上清，使用经焦碳酸二乙酯处理的水重悬沉淀并重复洗涤3次，获得mir-210@zif-8纳米颗粒。这一步骤的目的是：以去除游离mir-210、未反应锌离子和2-甲基咪唑。

27、优选的，上述步骤s1中甲基丙烯酰化透明质酸的制备方法具体为：s2中mir-210@zif-8在水凝胶质生物墨水中的终浓度为0.1～1.0mg/ml；优选的，上述恒温摄氏度t1条件设置为34-40℃。

28、优选的，上述恒温摄氏度t1条件设置为37℃；

29、优选的，上述s2中光引发剂溶液浓度为2.5%w/v；

30、优选的，上述步骤s2中甲基丙烯酰化透明质酸在水凝胶质生物墨水的终浓度为2.5%w/v，明胶在水凝胶质生物墨水的终浓度为3.0%w/v，氧化葡聚糖在水凝胶质生物墨水的终浓度为1.0%w/v，光引发剂在水凝胶质生物墨水的终浓度为0.25%w/v，mir-210@zif-8纳米颗粒在水凝胶质生物墨水的终浓度为0.5mg/ml；

31、优选的，上述透析袋1的截留分子量为3500-8000da；反应时间s为1.5h至2.5h。优选的反应时间s为2h。

32、优选的，上述透析袋1进行透析处理具体为在去离子水中透析4d，每8-12h更换一次透析液；

33、优选的，上述透析袋2进行透析处理具体为装入截留分子量为3500～8000da的透析袋2中，于去离子水中避光透析3d，每日更换透析液4次。

34、优选的，上述步骤s1中氧化葡聚糖的制备方法还包含有s1b-4，将氧化葡聚糖粉末避光密封保存。

35、优选的，上述步骤s1中甲基丙烯酰化透明质酸的制备方法还包含有s1a-5，将甲基丙烯酰化透明质酸密封保存于-20℃。

36、本发明的再一目的在于提供了的负载mir-210@zif-8的应力松弛水凝胶心脏补片在制备心肌梗死修复医用材料或抗心肌纤维化药物中的应用。

37、由上可知，本发明提供的一种负载mir-210@zif-8的应力松弛水凝胶心脏补片，复合水凝胶基质为双交联网络结构，双交联网络结构包括可光交联高分子形成的光交联稳定网络，以及含醛基多糖与含氨基蛋白质通过动态席夫碱键构筑的动态交联网络；动态交联网络具备应力松弛与应力耗散特性，光交联稳定网络维持水凝胶心脏补片结构与尺寸稳定性，mir-210@zif-8纳米颗粒具有酸性响应释药特性，通过动态交联网络实现心肌梗死区域异常机械刺激的耗散与松弛，同时利用酸性响应释药特性在缺血微环境中靶向释放mir-210以调控线粒体功能，从而协同干预力学微环境与代谢障碍双重病理过程，具有能够协同调控心肌梗死后异常力学微环境与缺氧代谢障碍，有效抑制线粒体过度分裂，显著提升心肌修复效果和抗纤维化能力。