用于卵巢癌的pH/氧化还原双重响应纳米载体及制备方法与流程

本发明属于纳米载体，具体涉及用于卵巢癌的ph/氧化还原双重响应纳米载体及制备方法。

背景技术：

1、现阶段临床针对卵巢癌的主流治疗方式以手术联合化疗为主，化疗在卵巢癌原位病灶及转移病灶的抑制治疗中发挥着核心作用。但传统游离化疗药物存在体内循环稳定性差、肿瘤靶向富集能力弱、正常组织非特异性损伤严重的问题，极易引发明显的全身毒副作用，同时卵巢癌细胞易启动药物外排机制与损伤修复机制，导致化疗耐药现象频发，大幅降低临床治疗效果，也是卵巢癌治疗后复发、预后不佳的核心诱因。

2、其中，基于肿瘤弱酸微环境与肿瘤细胞内高还原环境构建的ph/氧化还原双响应纳米载体，可实现肿瘤部位的靶向识别与胞内可控释药，有效提升化疗药物的肿瘤选择性与胞内蓄积量，相较于传统纳米载体具备显著应用优势。但现有常规ph/氧化还原双响应纳米递药体系仍存在诸多固有技术缺陷，难以满足卵巢癌精准高效治疗的临床需求。首先，现有双响应载体多采用单一条件触发释药的或逻辑响应机制，生理血液循环环境或正常组织微弱异常微环境即可触发药物提前泄漏，不仅降低药物有效利用率，仍存在一定的全身毒副作用，且无法实现药物的精准锁定与定点释放。其次，常规双响应载体仅具备简单的释药调控功能，缺乏稳定的物理屏障结构，在体内复杂环境中易出现结构扰动、响应基团提前激活的问题。因此，开发一种同时兼具同源靶向与深部穿透能力的一体化仿生智能纳米递药体系，是目前卵巢癌精准靶向化疗领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明提供了用于卵巢癌的ph/氧化还原双重响应纳米载体及制备方法；本发明以介孔二氧化硅为载体骨架，依次通过孔道内壁接枝二硫键构建氧化还原响应释药位点，表面交联聚组氨酸形成三维致密网络，实现正常生理环境稳定锁药、肿瘤微环境特异性精准释药；进一步通过胆固醇锚定方式将gala穿透肽稳定嵌入卵巢癌细胞膜，制备得到功能化仿生细胞膜囊泡并包覆于载药纳米颗粒表面，构建兼具同源靶向、免疫逃逸、长循环与肿瘤深部穿透特性的一体化智能递药体系；有效解决了传统递药体系释药精准度低、稳定性差、靶向穿透能力不足、脱靶毒性显著的技术缺陷，能够显著提升卵巢癌细胞内药物蓄积量、逆转化疗耐药、高效抑制肿瘤增殖与转移，兼具优异的生物安全性与临床转化应用价值。

2、针对现有技术的不足，本发明采取的技术方案如下：

3、本发明提供了用于卵巢癌的ph/氧化还原双重响应纳米载体，所述用于卵巢癌的ph/氧化还原双重响应纳米载体包括以下重量份的原料：5-15份功能化改性介孔二氧化硅纳米颗粒，5-15份功能化仿生细胞膜囊泡，2-8份盐酸阿霉素；

4、所述功能化仿生细胞膜囊泡包括以下质量比的原料：skov-3人卵巢癌细胞株:gala肽:胆固醇半琥珀酸酯=1:0.05-0.2:0.02；

5、所述功能化仿生细胞膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：

6、（1）skov-3卵巢癌细胞培养：将skov-3人卵巢癌细胞株培养于含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗的mccoy‘s 5a完全培养基中，于37℃、5% co2培养箱中培养至细胞融合度达到80-90%时，用于细胞膜提取；

7、（2）胆固醇锚定gala肽的合成：，采用固相合成法制备得到gala肽纯品，称取胆固醇半琥珀酸酯溶于无水dmf溶剂中，每1 μmol gala肽用无水dmf 0.3-0.5 ml，加入edc/nhs活化体系，室温搅拌30分钟活化羧基，再加入gala肽，室温条件下搅拌反应12 h进行酰胺化反应，反应结束后经高效液相色谱纯化，获得高纯度胆固醇锚定gala肽，冷冻干燥后于-20℃密封保存备用；

8、（3）skov-3细胞膜提取：收集培养至对数生长期的skov-3细胞，细胞总量5×107个，采用预冷pbs洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂（pmsf）的膜蛋白提取缓冲液，冰上裂解30分钟，使用杜恩斯匀浆器匀浆后，于4℃、1000×g离心10分钟，去除细胞核及未破碎细胞，取上清液于4℃、10000×g离心30分钟，沉淀即为细胞膜碎片，将膜沉淀重悬于预冷pbs中，得到细胞膜悬液；

9、（4）gala肽嵌入细胞膜：将细胞膜悬液与胆固醇锚定gala肽（与膜蛋白质量比为1:10）混合，于冰上孵育30分钟，使gala肽通过胆固醇锚插入细胞膜，孵育完成后，于4℃、10000×g离心10分钟，去除未嵌入的游离胆固醇锚定gala肽，用pbs重悬洗涤2次，得到功能化仿生细胞膜囊泡。

10、所述功能化改性介孔二氧化硅纳米颗粒包括以下重量份数的原料：0.1-0.3份十六烷基三甲基溴化铵（ctab），0.8-1.5份正硅酸四乙酯（teos），0.2-0.6份3-氨丙基三乙氧基硅烷，0.3-0.9份3,3‘-二硫代二丙酸，0.2-0.7份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc·hcl），0.1-0.4份n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），0.5-1.2份聚组氨酸；

11、所述功能化改性介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

12、i.将ctab溶于超纯水中，ctab与超纯水的用量比为1g:450-500ml，加入2 m naoh溶液调节ph至11.0，于80℃水浴中搅拌加热，待温度稳定后，缓慢滴加teos，持续搅拌反应2小时，反应结束后，离心收集白色沉淀，洗涤，将所得产物分散于含6 g/l nh4no3的乙醇溶液中，于60℃回流萃取12小时以去除ctab模板，离心收集产物，洗涤，40℃真空干燥，得到msn；

13、ii. 称取msn，分散于无水乙醇中，msn与无水乙醇的用量比为10-15mg:1ml，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于氮气保护下80℃回流反应24小时，反应结束后，离心收集产物，洗涤，40℃真空干燥，得到氨基化msn（msn-nh2）；

14、iii. 称取msn-nh2，分散于20 ml无水乙醇中，超声分散10分钟，加入3,3‘-二硫代二丙酸，同时加入edc·hcl和nhs作为活化体系，室温避光条件下磁力搅拌12小时，反应完成后，离心收集产物，洗涤，40℃真空干燥，得到二硫键功能化msn；

15、iv. 将聚组氨酸（plh）溶于无水二甲基亚砜（dmso）中，加入2-亚氨基硫烷盐酸盐（traut‘s试剂，与plh摩尔比为20:1），于室温、氮气保护下搅拌反应2小时，引入巯基，反应完成后，透析纯化24小时，冷冻干燥，得巯基化聚组氨酸；

16、v. 将二硫键功能化msn分散于ph 7.4的磷酸盐缓冲液（pbs）中，浓度为2 mg/ml，加入巯基化聚组氨酸（与msn-ss质量比为1.5:1），室温搅拌4小时，使plh-sh通过静电吸附结合于msn-ss表面，随后缓慢加入h2o2水溶液至反应液中h2o2的终浓度为0.01%，室温避光搅拌2小时，反应完成后，离心纯化，用pbs洗涤3次，冷冻干燥，得到功能化改性介孔二氧化硅纳米颗粒。

17、本发明还提供了用于卵巢癌的ph/氧化还原双重响应纳米载体的制备方法，具体包括以下步骤：

18、s1，将功能化改性介孔二氧化硅纳米颗粒与盐酸阿霉素按质量比2:1混合，避光条件下室温磁力搅拌24小时，利用介孔孔道物理吸附与二硫键化学锚定的双重作用负载药物，载药结束后，离心收集产物，用去离子水轻洗表面未负载的游离药物，冷冻干燥，得到载药纳米内核；

19、s2，将载药纳米内核分散于pbs中，与功能化仿生细胞膜囊泡按质量比1:1混合，采用聚碳酸酯膜挤出器反复挤出15-21次，使细胞膜均匀包覆于纳米颗粒表面，挤出后产物离心10分钟，用pbs重悬洗涤2次，得到所述用于卵巢癌的ph/氧化还原双重响应纳米载体。

20、与现有技术相比，本发明取得有益效果如下：

21、本发明通过溶胶-凝胶法结合模板萃取工艺制备介孔二氧化硅骨架，获得结构规整、孔隙均匀、比表面积优异的纳米载体基底，为阿霉素提供充足的负载空间，保障药物高效负载与稳定锚定。对载体进行氨基化改性，在颗粒表面与孔道内壁引入活性氨基官能团，为二硫键功能基团的共价接枝提供稳定反应位点。本发明通过酰胺化反应在孔道内壁共价接枝二硫键氧化还原响应基团，使载体孔道具备肿瘤胞内高还原环境特异性响应能力。正常生理环境中二硫键结构稳定，可牢固锚定阿霉素；进入卵巢癌细胞后，胞内高谷胱甘肽环境精准触发二硫键断裂，实现药物可控释放。同时，孔道内壁二硫键与表面交联网络在空间上形成分级响应结构，内层提供还原响应基础，外层提供ph响应屏障，二者协同构成双重保障。

22、本发明创新性对聚组氨酸进行巯基化改性，并通过氧化交联在载体表面构筑二硫键交联聚组氨酸三维网络，突破了传统单一ph响应的技术局限。生理中性环境下，交联网络致密封堵孔道，协同内层二硫键双重锁定药物，有效杜绝血液循环中的药物泄漏；肿瘤弱酸性环境下，聚组氨酸质子化使网络适度膨胀，但交联二硫键保持完整，不触发非特异性释药；仅当载体进入卵巢癌细胞，同时满足弱酸与高还原双重条件时，网络瓦解且孔道二硫键断裂，实现精准释放。

23、本发明采用胆固醇锚定方式将gala穿透肽稳定嵌入卵巢癌细胞膜。天然卵巢癌细胞膜赋予载体优异的生物相容性、免疫逃逸能力与同源靶向特性，延长体内循环时间，提升卵巢癌原位灶及转移灶的富集效率；嵌入的gala肽赋予载体ph响应性膜融合能力，促进肿瘤深部穿透，突破卵巢癌致密基质屏障。同时，外层仿生细胞膜形成生物保护壳，屏蔽内层ph敏感网络与二硫键响应结构，避免血液环境中的酸性或氧化还原物质干扰导致的提前激活，保障分级响应结构的功能完整性。