一种可ROS智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面水凝胶敷料及其制备方法

本发明涉及生物医用材料，具体涉及一种可ros智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面水凝胶敷料及其制备方法。

背景技术：

1、糖尿病足溃疡是糖尿病患者最严重的并发症之一，其治疗一直是临床医学的重大挑战。据统计，全球糖尿病患者已超过5亿，约19%-34%的患者一生中会发生足部溃疡，截肢后5年死亡率超过70%。糖尿病创面迁延不愈的根本原因在于其复杂的病理微环境。长期高血糖状态导致三大核心病理改变：其一，周围神经病变使患者对足部创伤无感知，且神经分泌功能异常导致皮肤干燥皲裂，为细菌侵入创造条件；其二，免疫功能障碍表现为中性粒细胞趋化、吞噬及杀菌功能受损，巨噬细胞清除凋亡细胞的能力下降，同时高血糖环境促进细菌生物膜形成，使创面易发感染且难以清除；其三，长期高血糖诱导的氧化应激导致ros水平持续升高，过量活性氧不仅直接损伤细胞膜和dna，还通过激活nf-κb等炎症通路持续维持炎症状态，使创面长期停滞于炎症期而无法向增殖期转换。上述病理因素并非孤立存在，而是相互强化、彼此促进，形成恶性循环。

2、目前临床常用敷料主要包括以下几类：传统纱布敷料成本低廉、吸收性好，但无法维持湿润愈合环境，且更换时易与新生组织粘连造成二次损伤；泡沫敷料和水胶体敷料能够吸收渗出液、维持湿润环境，但功能单一，缺乏主动调控创面微环境的能力；含银抗菌敷料虽具有广谱抗菌活性，但存在细胞毒性风险，长期使用可能导致银离子在体内蓄积，且已有耐药菌株报道；生长因子类敷料价格昂贵、半衰期短，需要频繁更换，患者依从性较差。现有敷料普遍存在功能单一、缺乏响应性释药能力、难以贴合不规则创面等共性问题，无法针对糖尿病创面感染难以控制、炎症持续不退、组织修复缓慢的复杂病理特征进行多维度协同调控。

3、近年来，基于活性氧响应机制的水凝胶敷料受到广泛关注，设计能够响应高活性氧微环境并按需降解、释放活性成分的水凝胶敷料被认为是糖尿病创面治疗的重要突破口，可注射自愈合水凝胶因其能够通过注射方式填充不规则创面、在受损后自发修复结构完整性等优势在该领域显示出独特应用前景。然而，现有活性氧响应性水凝胶仍存在明显不足：在功能层面，多数研究仅聚焦于抗菌或抗炎单一功能，缺乏对抗菌、抗炎、促组织再生的多靶点协同设计；在响应机制层面，通常仅依赖苯硼酸酯键等单一响应途径，响应效率和灵敏度有限；在材料设计层面，可注射性、自愈合性能与力学稳定性往往难以兼顾；此外，多数研究采用“添加剂”式设计，将抗菌剂、抗炎因子等简单混合于凝胶中，各组分独立发挥作用，缺乏机制层面的协同增效。因此，亟需开发一种能够同时实现抗菌、抗炎、促组织再生，具有多重活性氧响应机制和可注射自愈合性能的多功能水凝胶敷料。

4、本发明提出了一种可ros智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面水凝胶敷料及其制备方法。该敷料以plba与pva通过苯硼酸酯动态键形成可注射、自愈合的主网络，以hama在原位注射后经短时光照发生部分光交联并形成辅助网络，以原儿茶醛-cu2+纳米粒子作为活性氧响应性功能储库，原位注射后自动凝胶化形成水凝胶敷料。

技术实现思路

1、本发明旨在解决现有创面敷料修复效果不佳，难以应对创面复杂情况等复杂问题，提供一种可ros智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面敷料及其制备方法。

2、本发明采用以下技术方案实现：

3、一种可ros智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

4、1）通过酰胺化反应在聚赖氨酸上接枝苯硼酸，得到苯硼酸改性聚赖氨酸plba；

5、2）将原儿茶醛与cu2+在缓冲液中通过配位自组装，得到原儿茶醛-cu2+纳米粒子；

6、3）在聚乙烯醇pva溶液中依次加入甲基丙烯酰化透明质酸hama、光引发剂和原儿茶醛-cu2+纳米粒子，配制得到pva复合溶液，同时制备plba溶液；

7、4）将所述 pva 复合溶液与所述plba 溶液混合后得到水凝胶前驱体溶液，将水凝胶前驱体溶液经uv光照完成预凝胶化，再利用 plba 的苯硼酸基团与 pva 的羟基形成苯硼酸酯动态键，得到水凝胶敷料。

8、进一步的，步骤1）中，所述plba的具体制备方法为：

9、将重均分子量为6000-50000 da的聚赖氨酸溶解于去离子水中，配制浓度为10-20mg/ml的聚赖氨酸溶液，加入4-羧基苯硼酸，所述聚赖氨酸中赖氨酸残基与4-羧基苯硼酸的摩尔比为1:2-1:5；以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc和n-羟基琥珀酰亚胺nhs作为偶联剂，先将edc加入反应体系中，在0-8℃条件下活化30-60min，再加入nhs，于0-8℃继续反应30-60min；然后将反应体系升温至15-30℃，调节ph至7.0-8.0，以100-300rpm的搅拌速率继续搅拌反应12-24小时；

10、反应结束后，将反应液转移至截留分子量为3000-5000 da的透析袋中，用去离子水透析36-72小时，每4-8小时更换一次去离子水，透析结束后冷冻干燥36-60小时，得到苯硼酸接枝度为20%-50%的plba。

11、进一步的，所述edc的摩尔量为4-羧基苯硼酸的1.0-1.5倍，所述nhs的摩尔量为4-羧基苯硼酸的0.5-1.0倍。

12、进一步的，步骤2）中，所述原儿茶醛-cu2+纳米粒子的具体制备方法为：

13、将原儿茶醛溶解于ph 7.0-8.0的磷酸盐pbs缓冲液中，配制成浓度为5-15 mm的原儿茶醛溶液；将可溶性铜盐溶于去离子水中，配制成浓度为2.5-7.5 mm的铜盐溶液；在400-1000 rpm的搅拌条件下，以0.5-2 ml/min的滴加速度将所述铜盐溶液加入所述原儿茶醛溶液，滴加完毕后于室温下继续搅拌30-60min；其中，原儿茶醛与cu2+的摩尔比为2:1-4:1；

14、反应结束后，将反应液以10000-15000 rpm的转速离心10-20min，弃去上清液，沉淀用无菌去离子水重悬后再次离心洗涤，重复洗涤2-3次，最终重悬后得到原儿茶醛-cu2+纳米粒子。

15、进一步的，所述可溶性铜盐为氯化铜、硫酸铜和硝酸铜中的至少一种；所述原儿茶醛-cu2+纳米粒子的粒径为100-300 nm；步骤2）的操作均在避光条件下进行。

16、进一步的，步骤3）中，所述pva复合溶液和plba溶液的配制方法为：

17、将pva溶于ph 7.0-8.0的pbs缓冲液中，配制成浓度为10-30 mg/ml的pva溶液，加热至60-90℃并以100-300 rpm搅拌至完全溶解，冷却至室温备用；

18、在避光条件下向所述pva溶液中加入hama，使hama在所得 pva 复合溶液中的浓度为2%-6%（w/v），溶解完全后加入苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂lap光引发剂，使lap在所述 pva 复合溶液中的浓度为0.05%～0.2%（w/v），于50-70℃水浴溶解完全后冷却至室温，再加入占最终水凝胶中 plba 与 pva 总质量0.5%-5%的原儿茶醛-cu2+纳米粒子，涡旋振荡辅助分散5-15min并静置10-30min脱泡，得到pva复合溶液；

19、将plba溶于ph 7.0-8.0的pbs缓冲液中，配制成浓度为10-30 mg/ml的plba溶液并静置10-30min脱泡。

20、进一步的，步骤4）中，分别对所述pva复合溶液和所述plba溶液进行辐照灭菌；将灭菌处理后的 pva 复合溶液与 plba 溶液按体积比1∶1～1∶3混合，得到水凝胶前驱体溶液；将所述水凝胶前驱体溶液经18-26g针头挤出，对挤出后的水凝胶前驱体溶液采用波长为 365-405 nm、光强为 10～30 mw/cm2的光照处理 30-60 s，实现预凝胶化。

21、一种基于任一项所述的制备方法得到的可ros智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面水凝胶敷料。

22、可ros智能响应的抗菌-抗炎-促上皮修复多功能糖尿病创面水凝胶敷料在制备用于治疗糖尿病足溃疡或压疮的医用产品中的应用。

23、相对于现有技术，本发明具有以下优点：

24、1）材料体系的整体协同设计与组合创新。本发明将plba、pva与hama及原儿茶醛-cu2+纳米粒子组合，构建了由苯硼酸酯动态网络、hama部分光交联辅助网络与纳米粒子功能储库组成的复合水凝胶体系。其中，plba与pva通过苯硼酸酯动态键形成主网络，赋予敷料可注射性和自愈合性能；hama在原位注射后经短时光照发生部分光交联并伴随分子链缠结，形成辅助网络，不参与动态交联，不影响主网络的可注射性和自愈合性能；原儿茶醛-cu2+纳米粒子（100-300 nm）均匀分散于凝胶网络中作为活性氧响应性功能储库。各组分在性能上形成互补：plba单独使用时交联密度不足，pva单独使用缺乏响应性，原儿茶醛-cu2+纳米粒子单独使用无法提供物理屏障，hama单独使用缺乏动态响应性，四者组合实现了动态交联、骨架支撑与智能释药的功能集成。

25、2）凝胶网络结构的多级活性氧响应降解与骨架维持机制创新。本发明的水凝胶敷料具有多级活性氧响应降解机制，并辅以辅助网络的骨架维持机制。糖尿病创面中活性氧浓度显著高于正常组织（通常为正常组织的10-100倍），使得上述多级响应降解机制能够在创面微环境中高效发挥作用。第一重来自苯硼酸酯动态键：苯硼酸酯键在生理条件下稳定存在，但当过氧化氢等活性氧存在时，苯硼酸基团被氧化为苯酚，苯硼酸酯键发生断裂，导致凝胶主网络交联密度下降，且降解速率随活性氧浓度升高而加快，实现高活性氧时快速降解、低活性氧时缓慢降解的自适应响应。第二重来自原儿茶醛-cu2+纳米粒子的配位键：原儿茶醛分子中的邻二酚羟基与cu2+形成的配位键在活性氧环境下解离，释放出原儿茶醛和cu2+，原儿茶醛可直接与活性氧发生氧化还原反应将其清除，cu2+发挥抗菌和免疫调节功能，实现活性成分随活性氧水平按需释放。在高浓度活性氧条件下，纳米粒子中配位结构的解离加速，释放出原儿茶醛和cu2+，原儿茶醛发挥抗氧化作用清除过量活性氧，缓解活性氧对凝胶网络的氧化损伤，维持凝胶网络完整性，并通过ros响应性调控实现活性成分释放。此外，hama部分光交联辅助网络虽不直接响应活性氧，但随着苯硼酸酯主网络的逐步降解，原本被包裹的hama链逐渐暴露，通过部分光交联与分子链缠结维持凝胶的基本形态，防止敷料完全崩解，并可在创面中被透明质酸酶缓慢降解，其降解产物有利于细胞迁移和上皮化修复。多级响应与骨架维持机制在时间上形成配合：苯硼酸酯键断裂启动最早，纳米粒子解离紧随其后提供智能释放，辅助网络在主网络降解后提供持续保护和后期促修复功能，共同形成活性氧触发、成分释放、骨架维持的完整作用链条。

26、3）原儿茶醛-cu2+纳米粒子的构建与功能一体化创新。本发明将天然多酚原儿茶醛与cu2+通过配位自组装形成粒径100-300 nm的金属-多酚网络纳米粒子，实现了结构单元与功能单元的一体化设计。原儿茶醛分子中的邻二酚羟基既是与cu2+配位形成纳米粒子的结构基础，又具有直接清除活性氧和抗炎的生物学功能；cu2+既是配位中心，又承担广谱抗菌和免疫调节功能，并可通过促进巨噬细胞向 m2 型极化、改善炎症微环境而间接促进血管生成。与传统“添加剂”式设计相比，本发明的纳米粒子中配位键本身具有活性氧响应性，实现了活性氧触发、按需释药的响应模式。100-300 nm的粒径设计使其能够在凝胶三维网络中被均匀包裹并受到物理限域，实现长效缓释。同时该粒径范围既保证了纳米粒子的渗透性和分散稳定性，又避免了过小粒径（<50 nm）导致的快速清除或过大粒径（>500 nm）引起的团聚沉淀。

27、4）plba的合成策略创新。本发明采用edc/nhs化学偶联策略，其核心在于低温活化、室温偶联的两步法。先在4℃低温下将4-羧基苯硼酸的羧基活化为活泼酯中间体，低温条件有效抑制了活泼酯的水解和非特异性副反应；再升温至15-30℃并调节反应液ph至7.0-8.0条件下进行酰胺化反应，中性偏碱条件有利于聚赖氨酸侧链氨基（pka约9-10）去质子化，提高其亲核反应活性，从而获得较高的接枝效率，所得plba的苯硼酸接枝度为20%-50%。接枝苯硼酸后的聚赖氨酸既保留了聚赖氨酸本身的生物相容性和可降解性，又获得了苯硼酸的动态交联能力和活性氧响应性，是实现敷料可注射、自愈合、智能降解三重功能的关键分子基础。

28、5）时序性多重协同治疗机制与糖尿病创面临床问题的针对性匹配创新。本发明针对糖尿病创面感染难以控制、炎症持续不退、组织修复缓慢三大临床瓶颈，实现了抗菌、抗炎、促修复的多靶点时序性协同治疗。在抗菌方面，cu2+具有广谱抗菌活性，且其释放由活性氧触发，在感染或炎症相关的高活性氧微环境中进一步增强，实现响应性抗菌。在抗炎方面，本发明采用根源调控、辅助清除的双层次策略：cu2+可诱导巨噬细胞从促炎的m1表型向促修复的m2表型极化，可能与调控nf-κb、stat6等信号通路有关，原儿茶醛直接清除活性氧、切断炎症信号的持续激活源，两者协同将炎症微环境从促炎状态转变为促修复状态。在促修复方面，cu2+可间接促进血管内皮生长因子的表达，可能与稳定缺氧诱导因子-1α有关，hama在敷料降解后期暴露，促进角质细胞和成纤维细胞的迁移与增殖，原儿茶醛为修复过程提供神经保护支持。各治疗功能在时间上形成时序配合：植入初期活性氧水平最高，原儿茶醛快速清除活性氧并减轻氧化损伤，同时cu2+开始释放启动抗菌；随着纳米粒子持续降解，cu2+维持抗菌活性并诱导巨噬细胞m2极化，促进炎症向修复转变；主网络降解后，hama暴露并发挥促上皮化作用，使整体治疗效果优于单一功能的简单叠加。

29、6）制备工艺的普适性与可操作性创新。本发明的制备工艺具有以下突出优点：所有合成和配制步骤均在水相条件下进行，避免了有机溶剂的使用；各步骤可独立优化和放大，具有很好的工艺可控性和批次重现性；pva需先加热至60-90℃并搅拌至完全溶解，冷却至室温后，在避光条件下依次加入 hama、lap 和原儿茶醛-cu2+纳米粒子，得到 pva 复合溶液，既保证了 pva 的充分溶解，又避免了高温对纳米粒子的影响；pva复合溶液与plba溶液分别静置脱泡和灭菌，并在使用前才即时混合的设计避免了苯硼酸酯键过早形成导致的前驱体溶液储存不稳定问题；自向 pva 溶液中加入 hama 开始至原位注射后的光照处理前，相关操作均在避光条件下进行，以保障 hama 和 lap 的稳定性；配合临床使用时的无菌注射操作，为后续临床应用提供基础。上述工艺设计使本发明具有较强的普适性和可操作性。