一种透明-钙化双层软骨类器官及其制备方法与应用

本发明属于生物医用材料，涉及一种透明-钙化双层软骨类器官及其制备方法与应用。

背景技术：

1、关节软骨损伤是骨关节炎及创伤后关节退变的重要病理基础。由于关节软骨缺乏血管、神经和淋巴组织，且软骨细胞数量有限、代谢活性较低，损伤后通常难以实现自发修复。现有临床治疗方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植以及骨软骨移植等，但仍存在修复组织质量不佳、纤维软骨形成、供区损伤、供体来源有限以及长期力学稳定性不足等问题。

2、天然关节软骨并非均一组织，而是具有高度分层的骨软骨界面结构。其表层主要由富含col ii和aggrecan的透明软骨组成，能够承受关节负荷并维持低摩擦运动；深层则存在钙化软骨层，富含肥大化软骨细胞和矿化基质，在透明软骨与软骨下骨之间发挥重要过渡作用。钙化软骨层不仅能够增强软骨与软骨下骨之间的机械锚定，还可调控软骨-骨界面的物质交换和组织稳态。然而，当前多数软骨组织工程策略主要关注透明软骨再生，忽略了钙化软骨层在骨软骨界面重建中的作用，导致修复组织与宿主组织整合不足，长期稳定性受到限制。

3、近年来，类器官技术为组织再生提供了新的研究思路。类器官是由细胞在体外自组织或诱导形成的三维微组织，能够在一定程度上模拟天然组织的结构和功能。与传统细胞悬液或单一支架相比，类器官具有更高的细胞密度、更丰富的细胞外基质以及更接近天然组织的微环境，因此在骨、神经、肠道及软骨等组织修复中显示出良好应用潜力。此外已有大量研究证明透明软骨类器官能够促进软骨样基质形成并改善软骨缺损修复效果。然而，单一透明软骨类器官仍难以完整模拟天然骨软骨界面的分层结构，尤其缺乏钙化软骨层对界面整合和力学支撑的贡献。因此，开发具有透明软骨和钙化软骨双层结构的软骨类器官具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服现有软骨组织工程材料难以同时重建透明软骨层和钙化软骨层、修复组织界面整合不足和力学稳定性有限等问题，从而提供一种透明-钙化双层软骨类器官及其制备方法与应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一为提供一种透明-钙化双层软骨类器官，包括位于上层的透明软骨层和位于下层的钙化软骨层，通过紫外光交联所述透明软骨层和所述钙化软骨层形成双层软骨类器官，其中，

4、所述透明软骨层采用dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白水凝胶培养骨髓间充质干细胞构建得到，用于促进透明软骨样基质沉积；

5、所述钙化软骨层采用负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐水凝胶培养软骨细胞构建得到，用于诱导软骨细胞肥大化和矿化基质形成。

6、本发明的技术方案之二为提供一种如上述技术方案之一所述的透明-钙化双层软骨类器官的制备方法，包括如下步骤：

7、s1、制备负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐预混液，并加入软骨细胞，得到钙化软骨层打印前驱液；

8、s2、制备dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白预混液，加入骨髓间充质干细胞，得到透明软骨层打印前驱液；

9、s3、采用数字光处理生物打印技术依次打印s1步骤的钙化软骨层打印前驱液和s2步骤的透明软骨层打印前驱液，得到位于下层的钙化软骨层和位于上层的透明软骨层的双层结构；

10、s4、将s3步骤得到的双层结构置于成软骨诱导培养基中培养，获得透明-钙化双层软骨类器官。

11、在一些具体实施方式中，s1步骤，所述负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐预混液由如下步骤制备得到：

12、将y型dna单链和l型dna单链溶解于缓冲液中，混合形成dna超分子网络，加入甲基丙烯酰化海藻酸盐、光引发剂和碳酸钙颗粒，充分混匀，得到负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐预混液。

13、在一些具体实施方式中，s1步骤，所述负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐预混液中的甲基丙烯酰化海藻酸盐的浓度为5-15 wt%，光引发剂浓度为0.1-0.5 wt%，碳酸钙浓度为0.5-2wt%，dna单链总浓度为100-1000 nmol/ml；其中，

14、所述y型dna单链包括dna单链y1、dna单链y2和dna单链y3，其中，所述dna单链y1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述dna单链y2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述dna单链y3的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述dna单链y1、dna单链y2和dna单链y3的摩尔比是1：1：1；

15、所述l型dna单链包括dna单链l1和dna单链l2，其中，所述dna单链l1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述dna单链l2的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述dna单链l1和dna单链l2的摩尔比是1：1；

16、所述y型dna单链和l型dna单链的总摩尔比为1:1~1:2。

17、在本发明中，所述dna单链y1、dna单链y2、dna单链y3均具有三个粘性末端，所述dna单链l1、dna单链l2的两端各有粘性末端，所述l型dna单链能与y型dna单链的粘性末端完全互补。

18、在一些具体实施方式中，s2步骤，所述dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白预混液由如下步骤制备得到：

19、将y型dna单链和l型dna单链溶解于缓冲液中，混合形成dna超分子网络，加入甲基丙烯酰化丝素蛋白和光引发剂，混匀得到dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白预混液。

20、在一些具体实施方式中，s2步骤，所述dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白预混液中的甲基丙烯酰化丝素蛋白的浓度为5-15 wt%，光引发剂浓度为0.1-0.5 wt%，dna单链总浓度为100-1000 nmol/ ml；其中，

21、所述y型dna单链包括dna单链y1、dna单链y2和dna单链y3，其中，所述dna单链y1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述dna单链y2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述dna单链y3的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述dna单链y1、dna单链y2和dna单链y3的摩尔比是1：1：1；

22、所述l型dna单链包括dna单链l1和dna单链l2，其中，所述dna单链l1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述dna单链l2的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述dna单链l1和dna单链l2的摩尔比是1：1；

23、所述y型dna单链和l型dna单链的总摩尔比为1:1~1:2。

24、在本发明中，所述dna单链y1、dna单链y2、dna单链y3均具有三个粘性末端，所述dna单链l1、dna单链l2的两端各有粘性末端，所述l型dna单链能与y型dna单链的粘性末端完全互补。

25、在一些具体实施方式中，s1步骤，所述负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐预混液与软骨细胞的比例关系为1 ml：（1000000~30000000）个细胞；

26、s2步骤，所述dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白预混液与骨髓间充质干细胞的比例关系为1 ml：（1000000~30000000）个细胞。

27、在一些具体实施方式中，s3步骤，打印参数为：

28、紫外光交联时的紫外光波长为365 nm，光照强度为3-20 mw/cm2，光交联时间为10-60 s。

29、在一些具体实施方式中，s4步骤，所述成软骨培养基的成分为：含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1 mm丙酮酸钠、10 ng/ml转化生长因子-β3(tgf-β3)、0.1 μm地塞米松、1%its细胞培养添加物和1 μm抗坏血酸-2-磷酸盐的dmem高糖培养基。

30、在一些具体实施方式中，s4步骤，培养的时间为2~4周，温度为37°c。

31、本发明的技术方案之三为提供一种如上述技术方案之一所述的透明-钙化双层软骨类器官的应用，选自以下应用中的一种：

32、（1）用于制备软骨组织修复材料；

33、（2）用于药物筛选；

34、（3）用于疾病模型构建。

35、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

36、（1）本发明采用dna-甲基丙烯酰化丝素蛋白水凝胶构建透明软骨层，可促进骨髓间充质干细胞向稳定透明软骨表型分化。采用负载碳酸钙的dna-甲基丙烯酰化海藻酸盐水凝胶构建钙化软骨层，可通过ca2+释放促进软骨细胞肥大化和矿化软骨形成。因此，本发明构建了同时包含透明软骨层和钙化软骨层的双层软骨类器官，形成类似天然组织的力学梯度，能够更好模拟天然骨软骨界面的分层结构。

37、（2）本发明通过dlp生物打印实现透明软骨层和钙化软骨层的空间组装，能够形成具有结构梯度和力学梯度的仿生软骨类器官。

38、（3）本发明的透明-钙化双层软骨类器官可显著改善软骨缺损修复中的组织填充、表面平整度、软骨基质沉积和界面整合效果。