一类人群普适的mRNA-LNP疫苗及其制备方法

本发明属于医学领域。具体而言，本发明涉及一种构建基因集合的方法，所述方法构建的基因集合，所述基因集合中的任一基因的部分编码序列或全长编码序列、检测或调控所述基因的表达的分子在制备用于治疗肿瘤的药物或用于诊断肿瘤的诊断试剂中的用途，编码所述基因集合中任一基因所表达的蛋白质、其抗原性片段或者蛋白质或抗原性片段的变体的多核苷酸分子，包含所述多核苷酸分子的脂质体复合物，所述脂质体复合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的疫苗中的用途，以及调控选自所述基因集合中的任一基因的表达的靶向分子。

背景技术：

1、肿瘤是全球范围内的主要健康挑战之一，根据世界卫生组织国际癌症研究机构（iarc）发布的数据，2022年全球新增癌症病例数已达到约2000万例，死亡病例高达970万例1。在中国，癌症的发病率和死亡率也同样持续攀升。国家癌症中心的数据显示，2022年中国新增癌症病例数482万例，死亡病例为257万例，每年因恶性肿瘤所产生的医疗花费超过2200亿人民币。为有效减轻日益加重的癌症负担，我国已明确将推进危险因素综合控制、癌症筛查、早期诊断和治疗、诊疗方案标准化作为是2030年前有效减轻日益增加的癌症负担的关键策略2。

2、目前，癌症的传统治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但这些方法均存在局限性，如毒副作用大、易产生耐药性等。因此，开发更安全、有效的肿瘤早期预防或治疗策略，以减轻癌症负担，已成为是亟待解决的重大健康问题。现有的免疫疗法，如dna疫苗、anti-pd-1、单克隆抗体等，虽然展现了一定的疗效，但造价高昂、制作工艺复杂，切存在诸多风险。例如，dna疫苗可能诱发机体突变，免疫检查点抑制剂如anti-pd-1则可能导致活化的t细胞攻击正常组织、增加自身抗体及细胞因子，进而诱发自身免疫炎症，产生一系列免疫相关的不良反应。此外，单克隆抗体治疗周期长，患者容易产生耐药性。此外，免疫系统对其反应较弱或无法有效攻击的肿瘤被称为“冷肿瘤”，它们通常表现为低水平的免疫细胞浸润，肿瘤内部缺乏良好的血管生成，以及较低的免疫相关基因表达。冷肿瘤常常具有高水平的免疫抑制微环境，这意味着肿瘤可以逃避免疫监视，从而继续生长和扩散。例如，在胰腺癌、前列腺癌等癌症类型中，冷肿瘤较为常见，由于上述特性，这些肿瘤对传统免疫治疗的反应性较差，患者的预后也相对不佳，治疗难度极高，如何将冷肿瘤转变为热肿瘤以提高对pd-l1治疗的敏感性是冷肿瘤治疗的热门问题。因此，开发更有效的策略来提高冷肿瘤对免疫疗法的敏感性，是当前癌症治疗领域的一个重要研究方向。

3、mrna肿瘤疫苗是一种旨在靶向肿瘤抗原的核酸疫苗。这些肿瘤抗原通常由肿瘤细胞所表达或为肿瘤细胞所特有，释放后被抗原呈递至树突状细胞、巨噬细胞、b细胞等免疫细胞。随后，t细胞通过识别肿瘤组织的特异性抗原发挥杀伤作用。然而，这种肿瘤抗原表达水平较低，无法激活强有力的免疫反应。而mrna肿瘤疫苗则是由一段编码肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的mrna，以此为基础加以修饰和组装，完成制备并注射进入体内。疫苗被抗原呈递细胞吞噬后，依靠细胞的蛋白质合成系统翻译出特异性蛋白，作为“靶标”，诱导机体产生对“靶标”的免疫应答，进而针对性攻击肿瘤细胞。但裸露的mrna极不稳定，分子较大，具有亲水性以且带有负电荷。早期的mrna分子由于不稳定性和低表达效率而面临限制。未修饰的mrna会引发高免疫原性，通过toll样受体（tlr3、tlr7、tlr8和tlr9）激活先天免疫反应。随后将修饰的核苷（如m5c、m6a、m5u、s2u和伪尿嘧啶）纳入mrna配方中显著降低了它们的免疫原性，完全用伪尿嘧啶替代尿嘧啶提高了mrna的稳定性和翻译效率3。改造后的mrna疫苗具有许多优势。与基于dna的治疗方法相比，mrna疫苗不整合到宿主细胞基因组中，并无引发突变的风险。此外，mrna表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。总的来说，mrna疫苗无明显的毒副作用，且可以体外合成，制备工艺简单、快速。通过在宿主合成蛋白同时激活体液免疫和细胞免疫，mrna疫苗能够刺激机体产生高免疫应答率，是理想的抗肿瘤疫苗。当前对mrna癌症疫苗的研究主要集中在消除mrna的免疫原性和不稳定性、开发高效和有针对性的mrna递送系统，以及mrna疫苗的抗原寻找。目前，具有生物相容性的脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, lnps）已被验证为体内mrna传递的有效载体，在各种预防性和治疗性疫苗策略中进行递送。lnp在mrna递送中体现出优于其它载体的优越性，其未来的研究需要优化被动和主动策略，以提高lnp在mrna和药物递送中的性能和安全性。

4、随着两种covid-19疫苗的应用，mrna疫苗的流行度显著上升。在肿瘤治疗领域，mrna疫苗的研究也取得了显著进展。自2020年以来，mrna疫苗在肿瘤个性化治疗领域被广泛关注。目前，抗肿瘤mrna疫苗的策略主要分为两大类：

5、一、编码病毒抗原的mrna疫苗。这类疫苗适用于与病毒相关的恶性肿瘤，如人乳头瘤病毒（hpv）、乙型肝炎（hbv）、eb病毒（ebv）和艾滋病病毒（hiv），这些病毒与宫颈癌、肝癌和鼻咽癌等恶性肿瘤的发生密切相关。该类mrna疫苗为这些肿瘤提供了一种不同于传统预防性策略的治疗性策略，通过刺激身体的免疫系统识别和攻击表达这些病毒的抗原细胞。例如，最近的一项研究表明，一种信使rna-hpv治疗性疫苗（mhtv）在小鼠和非人灵长类动物中显示出强大的免疫原性和抗肿瘤效果，使得mhtv有望成为hpv相关疾病的治疗性和预防性疫苗4。

6、二、编码肿瘤抗原的mrna疫苗。这类疫苗通过编码肿瘤中表达高于正常组织的肿瘤相关抗原（tumor associated antigens, taas）、肿瘤特异表达或显著过度表达的肿瘤特异性抗原（tumor specific antigens, tsas），以及靶向肿瘤微环境中的免疫细胞并编码免疫调节因子，以达到免疫治疗效果。近年来，编码肿瘤抗原的mrna疫苗发展迅速，已经有部分疫苗进入了临床试验阶段。例如，autogene cevumeran（bnt122）是一种基于mrna疫苗技术的个性化癌症治疗药物，它利用mrna技术在人体细胞内进行内源性肿瘤抗原表达，从而激活特异性抗肿瘤免疫来攻击癌细胞。该疫苗与抗pd-l1抗体atezolizumab和化疗联用，在局部晚期或转移性实体瘤患者的i期临床试验中获得积极结果5。此外，mrna-4157编码34种针对个体患者肿瘤dna中独特突变的抗原，目前正在黑色素瘤、非小细胞肺癌和其他实体瘤的临床试验中。测试显示，mrna-4157与帕博利珠单抗（默克公司制造的抗pd1药物）联合用于头颈鳞状细胞癌患者的临床试验中，总响应率为50%，疾病控制率为90%。两项iib期临床试验结合mrna-4157和帕博利珠单抗用于高危黑色素瘤患者，分别降低了44%和49%的复发或死亡风险，表明治疗时间更长时效益更明显。目前，mrna-4157和帕博利珠单抗的联合疗法是第一个进入iii期临床试验（nct05933577）的mrna癌症疫苗6。

7、尽管mrna疫苗在抗肿瘤免疫治疗领域展现出了巨大潜力，mrna疫苗在实际应用中也面临诸多挑战。由于肿瘤细胞的突变种类繁多，异质性极高，高效且特异性的肿瘤新抗原的缺乏成为了其应用的一大瓶颈7。这一挑战尤其在针对多种肿瘤类型、覆盖广泛人群的预防性mrna疫苗的开发上尤为突出。如何找到人群普适性的新抗原表位，减少个性化肿瘤新抗原表位筛选的时间成本和金钱成本，从而实现对患者更及时的治疗，是新抗原mrna疫苗抗肿瘤疗法的进一步发展的关键。此外，如何设计lnp结构以排除潜在的炎症反应、提高mrna的稳定性和递送效率、降低免疫原性、确保长期安全性和有效性，也是亟待解决的问题。这些挑战凸显了开发更有效的mrna疫苗的重要性，以克服现有瓶颈，提高治疗效果，为肿瘤患者带来新的希望。

8、为了解决这些问题，科研人员已经开始探索优化策略，包括改进载体序列、抗原组合以及递送系统，以提高疫苗的免疫效果和安全性。例如，使用新的传递机制和改进的合成方法，能够进一步增强自扩增mrna的表达效率和生物稳定性。

9、在本发明中，所采用的mrna疫苗抗原源自一类精心筛选的编码人科特异蛋白的从头起源新基因，即人科特异的de novo基因。值得注意的是，这类基因在其他物种中通常作为非编码区域存在，而在人科中却获得了蛋白编码能力，理论上与全新的人科特有表型和疾病紧密相关。然而，由于其新生性，这类基因具有较小的开放阅读框（open readingframes，简称orfs）、较低的表达量及较窄的表达谱等特点8,9。此外，它们倾向于在重复序列中表达10,11，增加了其准确鉴定的难度，导致其缺乏充足可靠的体内表达和功能证据12,13。因此，在以往的研究中，这类特殊的基因往往被忽视。另外，由于缺乏同源性蛋白，准确鉴定存在困难，因此这些新基因的功能和对疾病影响的理解也较为滞后，且缺乏实验证据，长期在基因及功能研究中处于被忽略的地位14。尽管如此，已有部分研究揭示了这类新基因在睾丸中能维持精原细胞的活性15,16，而且在大脑发育中对于维持神经干细胞库的稳定性也至关重要10,17。这些功能暗示了它们在肿瘤发生发展中的潜在作用，一些病例研究已经将这些基因与肿瘤发展和预后相关联18-24。综上所述，人科特异的de novo基因与肿瘤发生发展密切相关。其中，由于独特的起源方法、年轻的基因年龄和不足的表达研究，这些基因在使用现有技术进行原癌基因筛选中被忽视，被错误地当做非编码基因，属于现有技术中原癌基因筛选中被忽略的一组基因。部分由这些基因翻译而来的蛋白在正常成年人体内表达量极低或表达谱极窄，仅在少数组织（脑和睾丸）或发育时期中有表达。而在肿瘤中，这些基因的突发性高表达，使其成为一类天然的肿瘤特异性抗原。鉴于这类抗原的特殊性质，本发明中的疫苗展现出特异性杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞的优良特性，这一结论在本发明的实施例中得到了验证。同时，这类抗原作为普适性抗肿瘤抗原，其应用场景远超过个性化抗原，有望成为抗肿瘤疫苗的关键突破点。此外，本发明还对脂质纳米颗粒（lnp）递送流程及lnp结构进行了设计优化，显著提升了疫苗的疗效及安全性。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供了一种构建基因集合的方法，所述方法包括：

2、（a）收集人科特异性从头起源新基因（de novo基因），并通过确定其基因和转录本结构排除错误或重复的候选基因，从而得到候选基因集合；

3、任选地（b）进行哺乳动物全基因组的同线性比对，以排除在祖先基因组中的直系同源区域有编码能力的候选基因；

4、任选地（c）进行同源性分析，以排除有复制起源可能性的候选基因；以及

5、任选地（d）进行转录谱分析，以筛选有体内蛋白质表达证明的候选基因。

6、在某些实施方式中，收集人科特异性de novo基因包括整合公开报道的人科特异性de novo基因。在某些实施方式中，所述人科特异性de novo基因是指人科特异性的新生人类基因。在某些实施方式中，确定基因和转录本结构的步骤可以通过序列相似性搜索来进行，例如利用gencode进行序列相似性搜索。在某些实施方式中，所述步骤（a）通过手动核实候选基因的编码序列区域和转录本的结构，以排除收集的de novo基因中错误或重复的候选基因。

7、在某些实施方式中，哺乳动物基因组的比对可以通过20种以上、40种以上、60种以上、80种以上、100种以上、110种以上或120种以上的哺乳动物的全基因组比对来进行。在某些实施方式中，本发明的哺乳动物选自表1中所列出的哺乳动物。在某些实施方式中，本发明的方法中用于哺乳动物基因组比对的基因组选自表1中所列出的基因组。在某些实施方式中，哺乳动物基因组的比对可以包括代表性灵长类物种的全基因组比对。在某些实施方式中，步骤（b）包括在系统发育树上对于每个候选基因评估其在共同祖先中的编码潜力。在某些实施方式中，如果重建的祖先orf的起始位点与候选基因精确对齐或在起始翻译位点下游的六核苷酸框内对齐，并且祖先序列的假定orf长度达到候选基因70%，则认为该祖先基因组中的直系同源区域有编码能力。在某些实施方式中，步骤（b）还包括基于灵长类全基因组比对结果，排除在外类群物种中起始密码子的缺失、移码或终止密码子的获得情况，以进一步确认这些候选基因（或孤儿蛋白质）的发现代表了人类最近的基因起源事件，而非在外部群体中丢失的祖先orf。

8、在某些实施方式中，步骤（c）中的同源性分析通过在人类和代表性外类群中同源性搜索进行，以排除有复制起源可能性的候选基因。在某些实施方式中，所述代表性外类群选自：pan troglodytes、pan paniscus、gorilla gorilla、pongo abelii、nomascusleucogenys、macaca mulatta、macaca fascicularis、callithrix jacchus、otolemurgarnettii、oryctolagus cuniculus、mus musculus、canis lupus familiaris、loxodontaafricana、monodelphis domestica，或其组合。在某些实施方式中，同源性搜索要求e值小于10-4、小于10⁻5、小于10⁻6或小于10-7，一致性大于30%、40%、50%或60%，和/或查询覆盖率大于40%、50%或60%。在某些实施方式中，在步骤（c）中，同源性搜索中具有映射到不同基因组位置、转录本或蛋白质的多个同源物的候选基因被排除在外。

9、在某些实施方式中，步骤（d）中的转录谱分析包括研究转录组数据、核糖体印记图谱（ribo-seq）数据集和/或质谱（ms）数据，优选地所述数据全面覆盖不同的人体组织和细胞系。在某些实施方式中，步骤（d）利用新生基因转录本独有的代表性区间进行定量。在某些实施方式中，代表性区间的定义涉及：识别并合并所有含有完整编码序列（cds）的转录本的外显子；排除那些与所有顺式反义基因的外显子发生重叠的区域；剔除长度小于100个碱基对（bp）的片段。在某些实施方式中，步骤（d）筛选出至少有1、2或3个独立研究的翻译证据支持其能翻译产生人科特异的蛋白质的基因合集。

10、在本发明的方法中，步骤（b）、步骤（c）和/或步骤（d）可以以任何顺序进行。

11、在某些实施方式中，第一方面的方法还包括：

12、（e）进一步筛选在成人正常组织中表达量低或表达谱窄，和/或在肿瘤中特异性高表达的基因。

13、在某些实施方式中，步骤（e）包括筛选在至少20个、至少23个、至少25个或至少27个人体组织中转录水平tpm≤0.5（所有正常组织低表达）或空间表达特异性≥0.75(表达谱窄)的基因。所述人体组织例如选自大脑皮层、额叶皮层、杏仁核、海马体、下丘脑、小脑、小脑半球、食管黏膜、左心室、甲状腺、乳腺、肺、胃、胰腺、肝、肾皮层、乙状结肠、横结肠、膀胱、皮肤、全血、卵巢、宫颈外膜、宫颈内膜、子宫、前列腺、睾丸，或其组合。在某些实施方式中，在肿瘤中特异性高表达是指在某一种或几种肿瘤中表达量tpm值上四分位数与对应正常样本比值倍数变化（fold change）>1.5。

14、在某些实施方式中，所筛选得到的在肿瘤中特异性高表达的基因如下所示（括号中为该基因特异性高表达的癌种）： rnf32-dt（luad、lusc、kirp、coad、skcm、ov、cesc）、tiparp-as1（gbm、lusc、lihc、kirc、kirp、blca、ov、prad）、linc01547（luad、ov）、tymsos（hnsc、thca、brca、luad、lusc、stad、lihc、kirp、blca、skcm、ov、cesc）、papln-as1（tgct）、odc1-dt（kirc、kirp）、adora2a-as1（kirc）、znf843（lgg、kirp）、aatbc（hnsc、coad、blca、ucec）、mocs2-dt（luad、lusc、kirc、kirp、coad、skcm）、sptssb（brca、luad、lusc、paad、ov）、myeov（luad、lusc、stad、paad、kirc、coad、blca、cesc）、tenm3-as1（hnsc、kirp、skcm）、mycnos（lgg）、linc00632（tgct）、elfn1-as1（esca、stad、paad、coad、blca、skcm、ov、cesc、ucec、prad）、linc02188（paad、kirc、kirp）、smim45（lusc、skcm、ov、cesc）。

15、在某些实施方式中，所筛选得到的在肿瘤中特异性高表达的基因如下所示（括号中为该基因特异性高表达的癌种）：serp1（lgg、kirc、kirp）；yif1b（hnsc、blca、skcm、ov）；myeov（luad、lusc、stad、paad、kirc、coad、blca、cesc）；znf843（lgg、kirp）；tymsos（hnsc、thca、brca、luad、lusc、stad、lihc、kirp、blca、skcm、ov、cesc）；tenm3-as1（hnsc、kirp、skcm）；adora2a-as1（kirc）；s pen-as1（kipr）；rnf32-dt（luad、lusc、kirp、coad、skcm、ov、cesc）；linc01547（luad、ov）；sptssb（brca、luad、lusc、paad、ov）；linc00632（tgct）；smim45（lusc、skcm、ov、cesc）；aatbc（hnsc、coad、blca、ucec）；exoc3-as1（lusc、kirc、kirp）；ensg00000224376（hnsc、kirp）；mycnos（lgg）；elfn1-as1（esca、stad、paad、coad、blca、skcm、ov、cesc、ucec、prad）；tiparp-as1（gbm、lusc、lihc、kirc、kirp、blca、ov、prad）；mocs2-dt（luad、lusc、kirc、kirp、coad、skcm）；odc1-dt（kirc、kirp）；papln-as1（tgct）；linco2188（paad、kirc、kirp）。

16、第二方面，本发明涉及通过第一方面的方法构建的基因集合。

17、在某些实施方式中，第二方面的基因集合包含选自以下的任意一种或多种基因：kcnk10、serp1、ensg00000145063、scp2d1-as1、yif1b、myeov、rpp38-dt、znf843、tymsos、tenm3-as1、adora2a-as1、eif3j-dt、spen-as1、chrm2、rnf32-dt、linc01547、pax8-as1、linc00523、sptssb、c20orf203、linc01565、linc00632、tdrg1、linc02397、ensg00000205414、smim45、aatbc、exoc3-as1、ensg00000224376、ntm-as1、mir137hg、satb2-as1、hdac2-as2、linc02370、ensg00000233290、mycnos、elfn1-as1、ensg00000243004、tiparp-as1、ubr5-dt、mocs2-dt、dnah10os、pbov1、ensg00000255384、znf252p-as1、cllu1、odc1-dt、papln-as1、linc02188、gtscr1、ensg00000279491、linc00602。

18、在某些实施方式中，第二方面的基因集合包含选自以下的任意一种或多种基因：rnf32-dt、tiparp-as1、linc0547、tymsos、papln-as1、odc1-dt、adora2a-as1、znf843、aatbc、mocs2-dt、sptssb、myeov、tenm3-as1、mycnos、linc00632、elfn1-as1、linc02188、smim45。

19、在某些实施方式中，第二方面的基因集合包含选自以下的任意一种或多种基因：serp1、yif1b、myeov、znf843、tymsos、tenm3-as1、adora2a-as1、spen-as1、rnf32-dt、linc01547、sptssb、linc00632、smim45、aatbc、exoc3-as1、ensg00000224376、mycnos、elfn1-as1、tiparp-as1、mocs2-dt、odc1-dt、papln-as1、linc02188。

20、第三方面，本发明涉及选自第二方面的集合的基因的部分编码序列或全长编码序列、检测或调控选自第二方面的集合的基因表达的分子在制备用于治疗肿瘤的药物或用于诊断肿瘤的诊断试剂中的用途。

21、在某些实施方式中，所述部分编码序列编码所选基因的抗原性片段或其变体。在某些实施方式中，所述抗原性片段或其变体可以用于产生针对肿瘤的抗体。

22、在某些实施方式中，所述部分编码序列或全长编码序列编码包含seq id no:1-420和seq id no:423-787中任一项所示的氨基酸序列或与seq id no:1-420和seq id no:423-787中任一项所示的氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的氨基酸序列的多肽。在某些实施方式中，所述全长编码序列包含seq id no:947-965中任一项所述的序列。在某些实施方式中，所述全长编码序列与seq id no:947-965中任一项所述的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性，并且编码与seqid no:947-965中任一项所述的序列所编码的完全相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述全长编码序列是seq id no:947-965中任一项所述的序列的密码子优化序列。

23、第四方面，本发明涉及一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码选自以下的基因所表达的蛋白质、其抗原性片段或者蛋白质或抗原性片段的变体：kcnk10、serp1、ensg00000145063、scp2d1-as1、yif1b、myeov、rpp38-dt、znf843、tymsos、tenm3-as1、adora2a-as1、eif3j-dt、spen-as1、chrm2、rnf32-dt、linc01547、pax8-as1、linc00523、sptssb、c20orf203、linc01565、linc00632、tdrg1、linc02397、ensg00000205414、smim45、aatbc、exoc3-as1、ensg00000224376、ntm-as1、mir137hg、satb2-as1、hdac2-as2、linc02370、ensg00000233290、mycnos、elfn1-as1、ensg00000243004、tiparp-as1、ubr5-dt、mocs2-dt、dnah10os、pbov1、ensg00000255384、znf252p-as1、cllu1、odc1-dt、papln-as1、linc02188、gtscr1、ensg00000279491、linc00602。

24、在某些实施方式中，所述多核苷酸分子编码选自以下的基因所表达的蛋白质、其抗原性片段或者蛋白质或抗原性片段的变体：rnf32-dt、tiparp-as1、linc0547、tymsos、papln-as1、odc1-dt、adora2a-as1、znf843、aatbc、mocs2-dt、sptssb、myeov、tenm3-as1、mycnos、linc00632、elfn1-as1、linc02188、smim45。

25、在某些实施方式中，所述多核苷酸分子编码包含seq id no:1-420和seq id no:423-787中任一项所示的氨基酸序列或与seq id no:1-420和seq id no:423-787中任一项所示的氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的氨基酸序列的多肽。在某些实施方式中，所述多核苷酸分子编码包含seq id no:9、seq id no:37、seqid no:130、seq id no:129、seq id no:191和seq id no:418-420中任一项所示的氨基酸序列或与seq id no:9、seq id no:37、seq id no:130、seq id no:129、seq id no:191和seq id no:418-420中任一项所示的氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的氨基酸序列的多肽。

26、在某些实施方式中，所述多核苷酸分子是mrna分子。在某些实施方式中，所述多核苷酸分子包含5’帽结构，优选在5’端包含cap1修饰。在某些实施方式中，所述多核苷酸分子中的至少50%、至少70%、至少90%、至少95%或100%的尿苷（u）被替换为假尿苷（ψ）。

27、在某些实施方式中，所述多核苷酸分子包含seq id no:788或seq id no:789所示的序列或与seq id no: 788或seq id no: 789所示的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的多核苷酸序列。在某些实施方式中，所述多核苷酸分子包含编码便于检测、分离和/或纯化的任何标签的序列，例如flag标签，如seq id no:790所示的序列或与seq id no:790所示的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的多核苷酸序列。

28、第五方面，本发明涉及一种脂质体复合物，所述脂质体复合物包括第四方面的多核苷酸分子，以及将多核苷酸分子包封在脂质壳中的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、磷脂、类固醇和/或peg脂质。

29、在某些实施方式中，所述脂质体复合物包含约40 mol%至约60 mol%的可质子化的阳离子脂质、约5 mol%至约20 mol%的磷脂、约30 mol%至约50 mol%的胆固醇和/或约0.1mol%至约5 mol%的peg脂质。在某些实施方式，所述脂质体复合物包含sm-102、dspc、胆固醇和/或dmg-peg2k，优选地所述脂质体复合物中sm-102/dspc/胆固醇/dmg-peg2k的比例为约50/约10/约38.5/约1.5。

30、第六方面，本发明涉及一种调控选自以下的基因表达的靶向分子：kcnk10、serp1、ensg00000145063、scp2d1-as1、yif1b、myeov、rpp38-dt、znf843、tymsos、tenm3-as1、adora2a-as1、eif3j-dt、spen-as1、chrm2、rnf32-dt、linc01547、pax8-as1、linc00523、sptssb、c20orf203、linc01565、linc00632、tdrg1、linc02397、ensg00000205414、smim45、aatbc、exoc3-as1、ensg00000224376、ntm-as1、mir137hg、satb2-as1、hdac2-as2、linc02370、ensg00000233290、mycnos、elfn1-as1、ensg00000243004、tiparp-as1、ubr5-dt、mocs2-dt、dnah10os、pbov1、ensg00000255384、znf252p-as1、cllu1、odc1-dt、papln-as1、linc02188、gtscr1、ensg00000279491、linc00602。

31、在某些实施方式中，所述靶向分子调控以下基因的表达：serp1、yif1b、myeov、znf843、tymsos、tenm3-as1、adora2a-as1、spen-as1、rnf32-dt、linc01547、sptssb、linc00632、smim45、aatbc、exoc3-as1、ensg00000224376、mycnos、elfn1-as1、tiparp-as1、mocs2-dt、odc1-dt、papln-as1、linc02188。

32、在某些实施方式中，所述靶向分子调控以下基因的表达：elfn1-as1、odc1-dt、sptssb、smim45、aatbc、myeov、tenm3-as1、linc01547、ensg00000224376、tiparp-as1、mocs2-dt、linc00632、papln-as1、exoc3-as1、pax8-as1、rnf32-dt、tdrg1、adora2a-as1、chrm2、ensg00000145063、c20orf203、yif1b、dnah10os、satb2-as1、serp1、linc00523、ensg00000255384、ensg00000233290、cllu1、linc02397、kcnk10、ensg00000279491、scp2d1-as1或linc02370。

33、在某些实施方式中，所述靶向分子调控以下基因的表达：elfn1-as1、odc1-dt、sptssb、smim45、aatbc、myeov、tenm3-as1、linc01547、ensg00000224376、tiparp-as1、mocs2-dt、linc00632、papln-as1、exoc3-as1、pax8-as1、rnf32-dt、tdrg1、adora2a-as1、chrm2、ensg00000145063、c20orf203、yif1b、dnah10os、satb2-as1、serp1、linc00523、ensg00000255384、ensg00000233290或cllu1。

34、在某些实施方式中，所述靶向分子调控以下基因的表达：odc1-dt、elfn1-as1、aatbc、sptssb、smim45、tiparp-as1、linc01547、mocs2-dt、myeov、tenm3-as1、papln-as1、linc00632、rnf32-dt或adora2a-as1。

35、在某些实施方式中，所述靶向分子将靶基因的表达降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。

36、在某些实施方式中，所述靶向分子是向导rna，优选地sgrna。在某些实施方式中，所述靶向分子是sirna。在某些实施方式中，所述靶向分子包含seq id no:791-946或seqid no:966-1031中任一项所示的靶向区域或与seq id no:791-946或seq id no:966-1031中任一项所示的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的靶向区域。

37、在某些实施方式中，所述sirna的反义链包含seq id no:966-1031中任一项所示的靶向区域或与seq id no:966-1031中任一项所示的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的靶向区域。在某些实施方式中，所述sirna的反义链还包含3’悬垂（例如“tt”）。

38、在某些实施方式中，所述sirna的反义链包含seq id no:947-965中任一项所示的序列中至少15nt、至少16nt、至少17nt、至少18nt或至少19nt的连续区段的互补序列。在某些实施方式中，所述互补序列不仅包括完全互补的序列，而且还包括基本上互补的序列，这意味着在本领域中已知的严格条件下，可以与所述连续区段杂交的序列。在某些实施方式中，所述sirna的反义链在严格条件下不与非靶区域杂交。在某些实施方式中，所述sirna的反义链具有低脱靶风险。

39、在又一方面，本发明涉及一种诊断、预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用第四方面的多核苷酸分子、第五方面的脂质体复合物或第六方面的靶向分子。

40、在又一方面，本发明涉及第四方面的多核苷酸分子在制备疫苗中的用途，所述疫苗用于治疗和/或预防肿瘤。

41、在某些实施方式中，本发明的肿瘤包括但不限于：

42、呼吸系统肿瘤：肺腺癌（luad）、肺鳞状细胞癌（lusc）、支气管源性癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌；

43、消化系统肿瘤：胃癌（例如胃腺癌（stad））、胰腺癌（如胰腺腺癌（paad））、结肠癌（如结肠腺癌（coad））、直肠癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌（esca，如食管腺癌）、肝细胞癌（lihc）、阑尾癌；

44、泌尿生殖系统肿瘤：膀胱癌（例如膀胱尿路上皮癌（blca））、肾透明细胞癌（kirc）、肾乳头状细胞癌（kirp）、前列腺癌（prad）、睾丸生殖细胞肿瘤（tgct）、卵巢癌、子宫内膜癌（ucec）、宫颈鳞状细胞癌（cesc）；

45、头颈部肿瘤：头颈部鳞状细胞癌（hnsc）、甲状腺癌（thca）、鼻咽癌、喉癌；

46、神经系统肿瘤：低级别胶质瘤（lgg）、多形性胶质母细胞瘤（gbm）、髓母细胞瘤、神经胶质瘤（如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤）；

47、皮肤及软组织肿瘤：皮肤黑色素瘤（skcm）、基底细胞癌、鳞状细胞癌、软组织肉瘤（如脂肪肉瘤、软骨肉瘤）、血管肉瘤（如卡波西肉瘤）、骨肉瘤；

48、血液系统肿瘤：白血病（如急性髓细胞性白血病）、淋巴瘤（如弥漫性大b细胞淋巴瘤）、多发性骨髓瘤；

49、乳腺及妇科肿瘤：乳腺癌（如乳腺腺癌、乳腺浸润性癌（brca））、卵巢癌（例如卵巢浆液性囊腺癌（ov））、外阴癌。

50、在某些实施方式中，本发明的示例性肿瘤包括但不限于：结肠癌、肺腺癌（luad）、肺鳞状细胞癌（lusc）、胃腺癌（stad）、胰腺腺癌（paad）、肾透明细胞癌（kirc）、结肠腺癌（coad）、膀胱尿路上皮癌（blca）、宫颈鳞状细胞癌（cesc）、低级别胶质瘤（lgg）、肾乳头状细胞癌（kirp）、头颈部鳞状细胞癌（hnsc）、甲状腺癌（thca）、乳腺浸润性癌（brca）、肝细胞癌（lihc）、皮肤黑色素瘤（skcm）、卵巢浆液性囊腺癌（ov）、子宫内膜癌（ucec）、食管癌（esca）、前列腺癌（prad）、多形性胶质母细胞瘤（gbm）以及睾丸生殖细胞肿瘤（tgct）。

51、综上所述，本发明针对现有技术的原癌基因筛选中被忽略的一组基因，这些人科特异的de novo基因保持细胞干性状态的功能使其属于天然的原癌基因。本发明方法所筛选到的抗原集合具有广谱性，是开发人群普适性疫苗的理想抗原候选。

52、本发明首先开创性地以人科特异的de novo基因集合为基础，通过本发明及其它研究已经证明这个集合中存在许多天然的原癌基因，且由于其新生特性，在普遍的基因筛选中常常被忽略，此前没有研究探索过这类基因作为抗肿瘤mrna疫苗的应用。本发明通过精细筛选，首先构建了一个人科特异的de novo基因集合，包含52个人科新生基因；在此基础上通过对表达量的进一步筛选，得到了含有18个基因的具有高度人群普适性和特异性的原癌基因抗原集合，为肿瘤疫苗的开发开辟了全新的路径。通过对tcga中大量患者案例的基因表达量分析，证明这些人科特异的de novo基因在大部分肿瘤患者中普遍表达，表明这些基因作为新抗原还具有广谱性的优良特性。综上，这一筛选方法不仅克服了传统肿瘤疫苗在抗原选择上的局限性，还确保了疫苗抗原能够特异性地靶向肿瘤细胞，而对正常组织细胞无伤害，从而在安全性、有效性和广谱性上实现了显著的提升。

53、此外，本发明还成功开发了针对这些新原癌基因的特异性mrna疫苗递送体系（lnp），这一技术创新不仅优化了疫苗的递送效率，还确保了疫苗抗原在体内的稳定表达和有效诱导免疫应答。更重要的是，本发明选取了elfn1-as1和tymsos抗原作为实施例，首先通过理化性质的验证mrna递送体系的有效性，并在人源化小鼠模型肿瘤模型中进行了单独接种和联合pd1-lail2免疫治疗接种的实验，接种本发明中的mrna疫苗显著减小了小鼠模型肿瘤大小，联合pd1-lail2免疫治疗使得治疗效果更明显。这进一步证实了该mrna疫苗递的有效性。实验结果不仅展示了疫苗能够激发强烈的特异性免疫反应，还直接在活体动物模型中证明了其抑制肿瘤生长的能力，这为后续的临床试验奠定了坚实的基础。而两个实施例的成果也有望推广到18个基因组成的人群普适的新抗原集合，并验证了初始52个人科特异de novo基因集合选取的正确性和未来潜力。

54、需要指出，本发明所提出的方法和技术体系具有广泛的适用性，不仅限于特定的肿瘤类型或人群，而且为未来基于个体基因组信息的精准肿瘤疫苗开发提供了重要的技术支撑和理论依据。随着基因测序技术的不断进步和肿瘤免疫学的深入研究，本发明所构建的抗原筛选方法和mrna疫苗递送体系有望在未来肿瘤免疫治疗中发挥更加重要的作用，为癌症患者带来更加安全、有效的治疗选择。

55、综上所述，本发明不仅在科学理论上取得了重要突破，还在技术实践上展现了巨大的应用潜力，为肿瘤疫苗的开发和肿瘤免疫治疗领域的发展做出了重要贡献。