四面体框架核酸-雷帕霉素复合物及其制备方法和用途

本发明涉及医药，具体涉及四面体框架核酸-雷帕霉素复合物及其制备方法和用途。

背景技术：

1、老年骨质疏松（senile osteoporosis，sop）构成了当前医学领域亟待解决的重要难题，这一复杂的全身性骨病特征在于骨量减少、骨微结构破坏及骨脆性增加，导致老年人群易于发生骨缺损、骨折。老年骨质疏松多发生于70岁以上的老年人，尤其是绝经后的老年妇女，起病隐匿，精准诊断与及时干预困难。抗骨质疏松药物（如双膦酸盐类、降钙素类、雌激素类等）治疗虽有一定疗效，但伴随的副作用及长期用药的潜在风险，如胃肠道反应、过敏反应及对肝肾功能的潜在损害，进一步增加了治疗难度。对于已发生骨缺损的患者，传统手术方法存在风险高、恢复慢等局限，而新兴的生物材料与组织工程技术虽提供了新视角，但仍需克服生物相容性和材料降解速率等关键挑战。因此，研发老年骨质疏松的新型低副作用药物与高效治疗方法成为解决老年骨质疏松及骨缺损治疗难题的关键路径。

2、雷帕霉素（rapamycin）是一种大环内酯类化合物，在过去作为免疫抑制剂治疗器官移植手术患者的排斥反应。近年来，人们逐渐发现雷帕霉素具有抗衰老、抗炎、抗癌等多种作用，其介导的丝氨酸/苏氨酸激酶复合物 1（mtorc1）抑制已被证明具有特殊的抗衰老干预效果，在多项研究中以多种剂量、给药周期和给药方案延长了异质遗传背景下的动物的寿命。有研究表明，雷帕霉素在调节骨稳态和骨改建中发挥重要作用，改善包括骨质疏松、脊柱退变性病变等在内的多种骨代谢疾病。雷帕霉素能够增强骨髓间充质干细胞成骨分化及增殖能力，降低成脂分化能力，同时增加破骨细胞凋亡。上述作用可能与其抑制mtor信号通路、激活细胞自噬有关。相比于其他抗衰药物，雷帕霉素效果稳定，安全性好，易于获取。然而，雷帕霉素也存在生物利用度低、水溶性低等应用局限性。因此，迫切需要一种能够持续、稳定地释放雷帕霉素于水溶液中的药物递送系统，以充分挖掘雷帕霉素在增强老年骨质疏松骨再生方面的巨大潜力。

3、近年来，纳米材料在生物医学领域的研究进展显著，凭借其独特的物理化学性质，在药物递送系统、生物检测与成像、组织工程与再生医学等多个方面展现出广泛的应用潜力。四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acids, tfna）是由4个等距单链dna (ssdna) 组成的三维四面体结构，可用于运输脂溶性化合物、dna和短肽等小分子物质，具备生物相容性、生物可降解性、结构稳定性、结构可调性和组织穿透性等多种优势，是一种具有广泛应用前景的药物载体。目前缺乏四面体框架核酸搭载雷帕霉素的相关研究及发明，四面体框架核酸能否提高雷帕霉素的功效及生物利用度仍需要进一步探索和证明。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提出四面体框架核酸-雷帕霉素复合物及其制备方法和用途，通过制备一种四面体框架核酸-雷帕霉素复合物，能够有效提高雷帕霉素在患者体内的药物吸收情况，提高药物利用率，进而提高老年骨质疏松的治疗效果。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：四面体框架核酸-雷帕霉素复合物，由四面体框架核酸和雷帕霉素按摩尔比1：10混合形成。

3、进一步，四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法，基于上述四面体框架核酸-雷帕霉素复合物进行，包括以下步骤：

4、将四条dna单链按照等摩尔比加入到含有96μl的tm缓冲液中，四条dna单链的终浓度为1μm，将tm缓冲液与四条dna单链充分混合，混合完成后加热至95℃保持10-15分钟，之后迅速降温至4℃并维持20-25分钟，制得1mmol/l的四面体框架核酸；再将1mmol/l的四面体框架核酸与雷帕霉素按照1：10比例混合并放置于4°c环境中进行振荡孵育4-5h，制得四面体框架核酸-雷帕霉素复合物。

5、进一步，四条dna单链的序列如下：

6、s1, atttatcacccgccatagtagacgtatcaccaggcagttgagacgaacattcctaagtctgaa；

7、s2, acatgcgagggtccaataccgacgattacagcttgctacacgattcagacttaggaatgttcg；

8、s3, actactatggcgggtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatcc；

9、s4, acggtattggaccctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccg。

10、进一步，tm缓冲液选用10mm tris-hcl和50mm mgcl2溶液制备。

11、进一步，tm缓冲液其ph＝8.0。

12、进一步，所述复合物用于细胞和动物实验前，溶剂为pbs和超纯水中的一种或多种，将复合物加入溶剂后使用0.22μm的无菌过滤器进行超滤。

13、采用上述方案有以下有益效果：

14、1、本发明所制备的复合体以四面体框架核酸为载体，搭载雷帕霉素，增强雷帕霉素的水溶性和入胞能力，将雷帕霉素运送至细胞内，增强其抗衰老功效。相比单独雷帕霉素处理，经四面体框架核酸-雷帕霉素复合物处理后，衰老骨髓间充质干细胞的成骨能力有所增强，伴随dna损伤标志物表达下调，显示出该复合物具备良好的抗衰性能。对早衰小鼠腹腔注射四面体框架核酸-雷帕霉素复合物2周，发现其骨缺损愈合情况明显优于对照组与单独雷帕霉素处理组，证明该复合体在抗老年骨质疏松中具备良好的应用前景。

15、2、本发明操作简单，通过加热和降温过程即可实现dna单链的自组装，形成四面体框架核酸。通过调整dna单链的序列和浓度，以及雷帕霉素的浓度和孵育时间，来控制复合物的结构和性质。本发明通过利用四面体框架核酸具有核酸酶抗性强和可编辑性强的特点将雷帕霉素进行混合，提高了雷帕霉素的水溶性和入胞能力。

16、3、本发明通过利用四面体框架核酸具有细胞组织渗透能力强、生物相容性及安全性良好的生物特性，使得雷帕霉素在四面体框架核酸的配合下，能够更好的作用于各个细胞组织，四面体框架核酸能够将雷帕霉素更有效地递送到目标细胞，提高作用效果，进而使得雷帕霉素更好的发挥其抗衰作用，从而达到提高骨质疏松治疗效果的作用。

17、进一步，四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的用途，基于上述四面体框架核酸-雷帕霉素复合物进行，所述复合物为治疗老年骨质疏松的药物。

18、有益效果：本发明所制备的复合物能够治疗老年骨质疏松。

19、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

1.四面体框架核酸-雷帕霉素复合物，其特征在于，所述复合物由四面体框架核酸和雷帕霉素按摩尔比1∶10混合形成。

2.四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法，基于上述权利要求1所述的四面体框架核酸-雷帕霉素复合物进行，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法，其特征在于，四条dna单链的序列如下：

4.根据权利要求3所述的四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法，其特征在于，tm缓冲液选用10mm tris-hcl和50mm mgcl2溶液制备。

5.根据权利要求4所述的四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法，其特征在于，tm缓冲液其ph＝8.0。

6.根据权利要求1-5所述的四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法，其特征在于，所述复合物用于细胞和动物实验前，溶剂为pbs和超纯水中的一种或多种，将复合物加入溶剂后使用0.22μm的无菌过滤器进行超滤。

7.四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的用途，基于上述权利要求2-6所述的四面体框架核酸-雷帕霉素复合物的制备方法进行，其特征在于，所述复合物为治疗老年骨质疏松的药物。