一种用于阿尔茨海默病的时序调控一体化自复制mRNA及冻干脑靶向制剂及制备方法与流程

本发明属于阿尔茨海默病（老年痴呆）长效无创基因治疗、自复制 mrna 载体工程、定点突变蛋白工程、脑靶向脂质纳米粒冻干制剂。本发明提供适配阿尔茨海默病全病程分层干预的时序调控一体化自复制 mrna 载体及配套常温冻干脑靶向制剂，可分别用于轻度认知衰退、中度、重度老年痴呆患者长效无创基因干预治疗。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（alzheimer’s disease, ad）是不可逆、进行性中枢神经退行性疾病，核心病理通路包含 aβ 斑块沉积、tau 蛋白过度磷酸化、持续性神经炎症、神经元端粒损耗、细胞表观衰老五类。现有临床一线药物仅能短期缓解认知症状，无法逆转病理损伤进程；反义寡核苷酸（aso）、小干扰 rna（sirna）等传统核酸药物需反复颅内穿刺给药，患者耐受度与临床依从性极低。

2、自复制 mrna（sarna）基于甲病毒骨架改造，可在宿主细胞内自主扩增，单次给药实现数月治疗蛋白表达，是长效中枢基因治疗理想载体。现有野生甲病毒 sarna、双分子拆分型 sarna 存在六大不可克服核心缺陷：

3、1. 中枢固有免疫毒性极强：野生 veev/sfv/sfv 复制过程持续大量生成 dsrna中间体，激活 tlr3/rig-i 通路，大量分泌 tnf-α、il-1β、ifn-α 促炎因子，诱发神经元大量凋亡，无法直接用于脑部给药。

4、2. 双分子载体共表达缺陷：现有多数技术将复制酶与功能融合蛋白拆分至两条独立核酸链，细胞转染后共表达效率低、长效表达稳定性差。

5、3. 重编程因子存在致瘤安全隐患：传统 oskm 载体包含原癌基因 c-myc；天然人tert 持续激活会引发基因组不稳定，且无分级时序表达调控、极端细胞清除兜底机制。

6、4. 野生功能蛋白存在专利侵权 + 双重临床毒性：野生 pf4、kl1 多肽被全球多件专利宽泛保护（氨基酸同源≥70% 即落入保护范围）；野生 pf4 含肝素结合基序，易诱发肝素诱导血小板减少症（hit）、血栓风险；天然 kl 持续激活 igf-1r、wnt 促增殖通路，长期给药存在细胞异常增殖风险。

7、5. 多顺反子翻译断崖衰减：行业普遍使用连续 (g4s)3长柔性肽，mrna 易形成 g- 四链体二级结构，核糖体通读受阻，下游蛋白表达量不足上游 30%，多靶点协同治疗失效。

8、6. 递送制剂储运与给药局限：常规 lnp 均为液体剂型，全程依赖冷链；仅适配单一给药路径，无法覆盖轻 / 中 / 重度 ad 患者分层诊疗需求，且无常温冻干成熟体系。

9、代表性对比文件缺陷汇总表

10、表格

11、;

12、综上，现有技术仅零散单点改进，无集低炎症载体、双层安全管控、均衡多顺反子翻译、双重专利规避突变、常温多途径冻干递送于一体的完整技术方案，临床与产业化空白巨大。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供用于阿尔茨海默病的时序调控一体化自复制mrna 及冻干脑靶向制剂，

2、1. 野生甲病毒 sarna 大量生成 dsrna 诱发脑部重度炎症；双分子拆分载体共表达效率低、长效表达稳定性不足；

3、2. 野生 pf4、kl1 落入现有专利宽泛保护范围，分别存在血栓、细胞异常增殖两类临床安全隐患；

4、3. 行业通用长 (g4s)3柔性接头造成 mrna 二级结构阻滞，下游功能蛋白翻译断崖式衰减，多通路协同治疗失效；

5、4. 重编程相关蛋白无分级可逆时序调控手段，载体突变、设备故障等极端场景下无细胞清除兜底方案，不满足全球基因治疗双重安全审评硬性标准；

6、5. 传统核酸递送液体制剂全程依赖冷链，给药途径单一，无法适配轻、中、重度阿尔茨海默病分层诊疗需求；

7、6. 现有创新点分散独立，竞品可拆分规避，缺少一体化集成、完整专利保护壁垒。

8、本发明全部复制元件、调控元件、多靶点融合蛋白、抗炎元件、自杀安全元件串联整合于同一条连续一体化自复制 mrna 核酸单链，区别于现有双分子拆分载体；配套专用多靶向常温冻干 lnp 组合物，六大模块协同作用，产生现有技术无法实现的预料不到治疗、安全、产业化综合效果。

9、模块一：nsp3 双定点突变 + 顺式 sriκbα 双重免疫弱化复制骨架

10、以 veev、sfv、sinv 任一甲病毒为复制骨架，在 orf1 编码 nsp1-nsp4 复制酶的nsp3 宏结构域引入 q48p、i113f 双定点突变，从复制源头减少 dsrna 中间体生成；同步在载体内置独立弱启动子驱动 sriκbα 抗炎小开放阅读框，双通路抑制脑组织 nf-κb 炎症信号轴，脑组织促炎因子整体下调 70% 以上，从根源解决野生 sarna 脑部给药重度炎症缺陷。

11、模块二：二代 sei 电磁场一级时序可逆安全调控盒（前置预防性开关）

12、改造 cyb5b 钙振荡感应元件，搭配 hsyn1/gfap 杂合 lgr4 神经特异性启动子构建 sei 调控盒，仅在神经元、星形胶质细胞内启动下游融合蛋白表达；标准化无创头颅交变电磁场参数：60hz 低频、2.0mt 磁场，采用 3 天刺激、4 天静默循环节律；撤除磁场 3～5 天后下游蛋白表达自发逐步衰减，实现生理周期可逆调控，作为第一层常规治疗安全屏障。

13、模块三：差异化 2a 搭配单段 (g4s)1短接头均衡多顺反子表达体系

14、摒弃行业通用连续 (g4s)3长柔性肽，全部功能单元仅使用单段 (g4s)1短柔性接头，搭配 p2a/e2a/f2a 差异化自切割肽线性串联六类功能蛋白；消除 mrna g - 四链体二级结构阻滞，各蛋白翻译表达量差值控制在 2 倍以内，保证 aβ 清除、抗炎、突触修复、端粒修复多通路同步起效。 orf2 完整线性排布序列： igg 分泌型 nls-(g4s)1-p2a-oct4pou-(g4s)1-e2a-sox2 hmg-(g4s)1-f2a-klf4 锌指 -(g4s)1-p2a - 突变 td-tert-(g4s)1-e2a - 突变 pf4-(g4s)1-f2a - 突变 kl1。

15、模块四：三重定点突变融合蛋白，序列 + 通路双重实现专利规避

16、剔除致癌 c-myc 片段，仅保留 oct4/sox2/klf4 dna 结合核心截短结构域；设计三类原创人工突变蛋白，突变体与对应野生蛋白氨基酸同源性≤85%，同步阻断在先专利核心分子互作通路、消除野生蛋白临床毒性，整体药效仅小幅衰减 11.5%：

17、1、突变 pf4（seq id no:5）：n 端 1-10 位全丙氨酸扫描突变叠加 r22s/r24s/h25s 肝素结合位点替换；cxcr3、肝素结合亲和力下降≥50%，彻底杜绝 hit 血栓风险，完整保留 trem2 介导小胶质抗炎、aβ 吞噬功能；

18、2、突变 kl1（seq id no:6）：igf-1r、wnt 配体关键位点定点替换，下调促增殖通路活性，完整保留 nmdar 依赖突触保护、抗氧化活性；

19、3、突变 td-tert（seq id no:4）：灯塔水母来源 rt 催化区 l312a/i113v 温和突变，降低细胞无限克隆增殖概率，保留神经元端粒损伤修复能力。

20、模块五：人源 icasp9 二级应急自杀安全盒（极端兜底屏障）

21、通过 ires 弱驱动人源诱导型 caspase9 自杀基因，腹腔注射小分子 ap1903 后24 小时内特异性清除全部转染神经元、胶质细胞，对正常未转染细胞无损伤；与 sei 电磁场调控工作原理、适用场景完全独立不可替代：电磁场依赖外部设备用于常规周期调控，icasp9 不依赖器械，针对载体突变、磁场设备失效等极端风险兜底，满足全球基因药物双重安全强制审评标准。

22、模块六：多靶向常温冻干脑靶向 lnp 制剂

23、基础脂质摩尔配比浮动区间：sm-102 40～55mol%、dspc 8～12mol%、胆固醇 35～40mol%、dmg-peg2000 1～2mol%；可电离脂质替换 alc-0315、中性磷脂替换 dope 时制备工艺不变。分三类靶向剂型适配全病程患者：

24、1、静脉制剂：dmg-peg2000 末端偶联 rvg29 跨血脑屏障肽；

25、2、鼻腔雾化制剂：偶联乙酰胆碱嗅神经靶向配体；

26、3、鞘内注射制剂：无靶向修饰，简化生产、降低成本。 添加 5wt% 海藻糖真空冻干，冻干粉常温避光稳定储存≥6 个月；lnp 粒径 80～120nm，pdi≤0.3，mrna 封装效率≥85%；单次给药后脑内治疗蛋白稳定表达 3～6 个月，无需反复颅内穿刺。

27、一体化自复制 mrna 完整 5’→3’元件线性排布（对应附图 1）

28、1、cap1 cleancap 共转录 m1ψ 修饰 5’非翻译区，内置标准 kozak 翻译起始序列；

29、2、orf1：veev/sfv/sinv nsp1-nsp4 复制酶，nsp3 携带 q48p/i113f 双免疫弱化突变；

30、3、甲病毒 26s 亚基因组启动子；

31、4、sei 电磁场时序诱导调控盒（cyb5b 元件 + hsyn1/gfap 杂合 lgr4 神经启动子）；

32、5、orf2 分段差异化 2a 融合蛋白阅读框；

33、6、独立弱启动子驱动 sriκbα 内源抗炎小开放阅读框；

34、7、ires 顺式连接人源 icasp9 自杀基因盒；

35、8、精简人 α- 珠蛋白 3’非翻译区；

36、9、90nt 固定长度 poly (a) 尾；

37、10、t7 体外转录终止子； 成熟一体化自复制 mrna 全长 15649nt，体外转录 dna模板全长 15671bp；全编码区尿苷替换 n1 - 甲基假尿苷 m1ψ；离子交换 hplc 纯化后双链 rna 杂质残留质量分数＜0.1%。

38、本发明的技术效果和优点：

39、1、双重免疫弱化机制，解决脑部 sarna 核心瓶颈 nsp3 源头减少 dsrna 生成 +sriκb 胞内抗炎双通路协同，脑组织促炎因子下调 70% 以上；现有技术仅单一改造，无法达到同等低炎症效果，为本发明独有中枢适配载体平台。

40、2、双层独立互补安全架构，具备非显而易见优势 电磁场可逆时序调控（常规治疗）、小分子诱导细胞清除（极端兜底）两套系统完全分割，现有载体仅单一开关，无法满足新药双重安全审评硬性要求，临床申报风险大幅降低。

41、3、短接头均衡翻译，实现多通路同步协同治疗 摒弃 (g4s)3长接头造成 mrna 二级结构阻滞，六类功能蛋白表达差异控制 2 倍以内，aβ 清除、抗炎、突触修复、端粒修复同步起效，解决现有多顺反子下游蛋白大幅衰减缺陷。

42、4、双重突变实现专利规避，同步消除临床毒性 三重突变蛋白氨基酸同源≤85%，同时改变氨基酸序列与核心互作通路，脱离在先专利宽泛保护范围；仅损失 11.5% 药效，完全消除血栓、细胞增殖两类安全风险，现有单点截短突变无法同时实现侵权规避与安全平衡。

43、5、三剂型常温冻干制剂，大幅提升临床依从性 一套脂质骨架衍生静脉、鼻腔、鞘内三类给药产品，覆盖轻、中、重度阿尔茨海默病；冻干粉无需冷链，居家雾化、基层医院均可使用，单次给药长效表达，规避重复颅内穿刺痛苦。

44、6、六大模块一体化集成，竞品无法拆分规避 单独 nsp 突变、单独自杀基因、单独突变蛋白、单一 lnp 冻干体系均存在明显短板；本发明将全部创新整合于单条核酸链并配套专用制剂，任意对比文件单独或组合均无法复刻同等抗炎、安全、长效综合效果，专利壁垒完整。

45、7、全流程成熟 gmp 工业化工艺 t7 m1ψ 共转录、离子交换纯化、微流控组装、真空冻干均为核酸药物标准化量产工艺，无稀缺原料、超高门槛设备，千升级放大可行，量产成本可控，产业转化价值高。

46、8、多层知识产权分案布局 seq4 突变 td-tert、seq5 突变 pf4、seq6 突变 kl1、冻干制剂、电磁场治疗方法、制备工艺均可独立分案申请，多维度延长知识产权保护周期。