一种发酵物及其制备方法与在治疗银屑病中的应用与流程

本发明涉及生物，具体地说，涉及一种发酵物及其制备方法与在治疗银屑病中的应用。

背景技术：

1、中医是传统诊疗手段，对银屑病有不少方剂。不少研究者将银屑病的本质归于血热证、血燥证或血瘀证。近年来，益生菌与菌群调节干预银屑病研究日益增多，在临床上已经有用混合益生菌治疗银屑病的案例。有研究发现银屑病患者肠道存在紊乱情况，并且不同症候患者肠道菌群存在较大差异。总而言之，银屑病影响着患者症候以及肠道微生态。

2、但现有银屑病治疗方法仍存在不少问题。例如，传统药物治疗副作用明显且无法根治；生物制剂成本高昂、存在感染风险且存在疗效个体差异；光疗对皮肤有损伤风险且对关节症状无直接作用；益生菌与菌群调节单独使用对中重度患者效果较弱，需联合其他疗法，个体差异大且需长期维持，停用后效果可能逐渐消失。

3、因此，仍有必要研究新的银屑病治疗方法

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种新的有效治疗银屑病的方法。

2、本发明提供了一种制备发酵物的方法，其包括由副干酪乳酪杆菌lp007发酵含中药组合物提取液的底物的步骤；所述中药组合物按重量份计包括：黄芪19-21份、党参11-13份、白术5-7份、茯苓9-11份、当归9-11份、赤芍9-11份、知母9-11份、麦冬9-11份、桃仁9-11份、红花9-11份、胆草5-7份、黄芩5-7份、双花14-16份、连翘9-11份、栀子9-11份、地龙5-7份、甘草5-7份；所述发酵物中副干酪乳酪杆菌lp007的活菌数为109-1010cfu/ml；所述副干酪乳酪杆菌lp007的保藏编号为：cgmcc no.32193。

3、银屑病是系统性疾病。本发明针对性筛选适合特定中药发酵的优良菌株，制备出的发酵物可从系统层面治疗银屑病，使益生菌和中药的功效最大化。本发明的中药能系统性调理患者体质，而特定益生菌副干酪乳酪杆菌lp007则不仅能缓解银屑病的发展且可起到调节肠道菌群的作用，还能协助中药发挥功效，提高人体吸收率和生物利用度，增进药效。二者相辅相成，克服了益生菌或中药单独作用时功效弱的缺陷。

4、本发明的中药组合物主要有三方面的功效，具体如下：

5、1. 扶正补虚：黄芪、党参、白术、茯苓可健脾益气，麦冬能养阴生津，有助于改善患者因银屑病可能出现的正气不足、气血亏虚的情况，增强机体抵抗力。

6、2. 活血化瘀：当归、赤芍、桃仁、红花具有活血化瘀的作用，可改善银屑病患者局部皮肤的血液循环，减轻血瘀导致的皮肤红斑、鳞屑等症状。

7、3. 清热利湿解毒：知母、胆草、黄芩、双花、连翘、栀子均有清热泻火解毒的功效，可帮助清除体内热毒，对于银屑病急性期的红斑、瘙痒、灼热等症状有缓解作用，甘草调和诸药，地龙还可通络，有助于改善病情。

8、本发明研究发现副干酪乳酪杆菌lp007可提高上述中药配方的物质生物转化效率，提高中药复方提取液中活性物质的含量，同时复方中的特定化合物为副干酪乳酪杆菌的生长提供营养物质，促进其功效发挥。若换用其他类似菌株，最终发酵物中活菌数降低，且可治疗银屑病的活性成分含量降低，无法实现本发明方法制备的发酵物的治疗效果。

9、此外，本发明的副干酪乳酪杆菌lp007还可将底物分解成易吸收的物质和小分子营养物质，从而赋予产品更丰富的营养结构。且副干酪乳酪杆菌lp007还能降低肠道炎症因子水平，调节机体免疫，与中药的作用相辅相成。此外，副干酪乳酪杆菌lp007发酵中药产生的有机酸及醇类物质有利于改善中药制剂的口感，有利于被患者接受。

10、本发明发酵物的制备还可机械化自动操作，有利于实现工业化规模生产。

11、本发明的副干酪乳酪杆菌（

lacticaseibacillus paracasei）lp007的保藏编号为：cgmcc no.32193，公开于中国专利申请cn120230681a中。

12、优选，所述中药组合物按重量份计包括：黄芪20份、党参12份、白术6份、茯苓10份、当归10份、赤芍10份、知母10份、麦冬10份、桃仁10份、红花10份、胆草6份、黄芩6份、双花15份、连翘10份、栀子10份、地龙6份、甘草6份；所述发酵物中副干酪乳酪杆菌lp007的活菌数为1010cfu/ml。

13、本发明的方法中，所述底物包括：0.2-0.5 mg/ml所述中药组合物提取液和mrs液体培养基。

14、优选，所述底物包括：0.3 mg/ml所述中药组合物提取液和mrs液体培养基。

15、作为一个具体实施方式，每1000ml所述底物包括：300 mg所述中药组合物提取液、葡萄糖30g、磷酸氢二钾5g、牛肉膏15g、无水乙酸钠6g、大豆蛋白胨10g、酵母粉10g、柠檬酸铵1g、一水合硫酸锰0.04g、7水合硫酸镁0.2g、吐温-80 1g；所述底物的ph为6.5-7。

16、优选，在底物灭菌前用25% naoh调节ph为6.5-7。

17、本发明的方法中，所述中药组合物提取液的制备方法为水提法。

18、本领域技术人员可根据常规方法进行本发明中药组合物提取液的制备。

19、作为一个具体实施方式，本发明的方法中，所述中药组合物提取液的制备方法包括：

20、（1）按照配方分别称取各味中药，以8-10倍体积水浸泡3.5-4.5 h；煎煮0.8-1.2h，纱布过滤，收集药液，重复2-3次；

21、（2）往过滤后的药渣中加入8-10倍水继续煎煮0.8-1.2h，用纱布过滤，收集药液，重复2-3次；

22、（3）将药液合并，水浴浓缩至固含量为15%-50%，3500-7000rpm离心5-30min，弃沉淀后灭菌获得所述中药组合物提取液。

23、本发明的方法中，所述发酵的条件为：温度为35-37℃，发酵时间为18-24 h，接种量为6%-10% v/v。

24、本发明还提供一种发酵物，其由上述方法制备获得。

25、本发明还提供上述发酵物在制备治疗银屑病产品中的应用。

26、本发明的应用中，所述产品为药品，所述药品还包括药学上可接受的辅料。

27、本领域技术人员可根据本领域公知常识，通过添加不同辅料将本发明的发酵物制备为各种药物剂型，优选，本发明的药品为口服液。

28、作为一个具体实施方式，本发明的益生消银剂制备方法如下：

29、1、副干酪乳酪杆菌lp007的活化：（1）按照mrs培养基配方精确称取各物质，加入适宜蒸馏水，边搅拌至完全溶解，灭菌（121℃，20 min）备用；（2）往无菌试管内加入mrs液体培养基，挑入单菌落混匀，进行培养，得到一代菌液备用；（3）吸取100 ul一代副干酪乳酪杆菌lp007接入5 ml mrs液体培养基，混匀，继续培养，即得后续操作所用菌液。

30、具体如下：培养基配制：

31、配方：葡萄糖20-30g、磷酸氢二钾2-5g、牛肉膏10-20g、无水乙酸钠4-7g、大豆蛋白胨5-10g、酵母粉5-10g、柠檬酸铵0.5-2g、硫酸锰（1h2o）0.03-0.05g、硫酸镁（7h2o）0.1-0.2g、吐温-80 1-3g、纯化水1000ml。

32、灭菌前用85%磷酸或25% naoh调节ph为6.5±0.1，121℃、15分钟灭菌。

33、一级种子培养液配制：配方中硫酸镁和硫酸锰单独溶解（70-80℃水），其他除葡萄糖外的物料混合后用烧至100℃后冷却到70-80℃的水溶解，将各溶液混合搅拌溶解、定容（定容时加入的水量应减去溶解葡萄糖的水量）后，将培养液冷却到25-28℃，用25%氢氧化钠或85%磷酸调节ph 6.4-6.6，121℃、15min灭菌。灭菌后培养液降温的过程中加入单独灭菌的葡萄糖溶液。

34、二级种子培养液配制：配方中硫酸镁和硫酸锰单独溶解（70-80℃水），其他除葡萄糖外的物料混合后用烧至100℃后冷却到70-80℃的水溶解，将各溶液混合搅拌溶解、定容（定容时加入的水量应减去溶解葡萄糖的水量）后，将培养液冷却到25-28℃，用25%氢氧化钠或85%磷酸调节ph 6.4-6.6，高压蒸汽121℃、15min灭菌。灭菌后培养液降温的过程中加入单独灭菌的葡萄糖溶液。

35、接种：

36、一级种子培养：将-80℃或-40℃冷冻保存的冻干工作种子在局部百级超净工作台中，无菌操作接种于121℃、15min灭菌后的一级液体培养基中，35-37℃恒温需氧培养20-24h；

37、二级种子培养：一级种子按6%-10%（v/v）接种量接种于二级培养基中，二级培养基35-37℃恒温需氧培养至ph=4.3-4.4。

38、2、复方提取液的制备

39、（1）按照中药配方分别称取各味中药，于提取装置中加8-10倍体积水浸泡3.5-4.5h；煎煮0.8-1.2h，纱布过滤药液至锥形瓶中，重复2-3次；

40、（2）往过滤后的药渣中加入8-10倍水继续煎煮0.8-1.2h，纱布过滤药液至锥形瓶中，重复2-3次；

41、（3）将上述所得药液合并，水浴浓缩至固含量为15%-50%（优选35%），离心，弃沉淀，分装灭菌（121℃，20 min），即得制备好的复方提取液。

42、3、发酵

43、发酵培养基包括复方提取液和mrs液体培养基。具体配方如下：

44、每1000ml发酵培养基（底物）包括：200-500 mg上述复方提取液（中药组合物提取液）、葡萄糖20-30g、磷酸氢二钾2-5g、牛肉膏10-20g、无水乙酸钠4-7g、大豆蛋白胨5-10g、酵母粉5-10g、柠檬酸铵0.5-2g、一水合硫酸锰0.03-0.05g、7水合硫酸镁0.1-0.2g、吐温-801-3g。

45、培养基使用车间制纯水配制。将除硫酸镁、硫酸锰和葡萄糖外的其他物料在配料桶中先加70-80℃左右水人工初步搅拌溶解后，倒入装有70-80℃左右水的配料罐中，然后再倒入单独溶解的硫酸镁和硫酸锰，开搅拌30-40min，搅拌溶解后打料到发酵罐中（定容时加入的水量应减去溶解葡萄糖的水量），灭菌前用25% naoh调节ph为6.5-7。

46、除单独灭菌的葡萄糖外，发酵培养基高压蒸汽121℃灭菌15min。灭菌后培养基降温的过程中将单独灭菌的葡萄糖溶液打到发酵罐中。

47、将二级种子培养结束后的菌液按照6%-10%（v/v）接种量接种于发酵罐中。发酵参数为：发酵温度为35-37℃，发酵时间为18-24 h。

48、本发明的有益效果至少在于：

49、本发明通过副干酪乳酪杆菌lp007对含特定中药提取物的底物进行发酵，促进了中药成分的生物转化，提升了有效活性成分的含量，通过益生菌和发酵产物共同作用，提升了治疗银屑病的效果。