一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒及其检测方法与流程

本技术涉及生物检测，尤其是涉及一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、神经丝轻链蛋白是一种神经元细胞质蛋白，主要分布于中枢和周围神经元的胞体及轴突中，参与构成神经元细胞骨架，对维持轴突口径、径向生长和信号传导速度具有关键作用。当神经轴突受损或发生变性时，神经丝轻链蛋白会从损伤部位释放至细胞间质，并进一步进入脑脊液和外周血，其释放量与轴突损伤程度呈显著正相关。因此，神经丝轻链蛋白已被公认为反映神经轴突损伤和神经变性进程的重要生物标志物。近年来，大量研究表明，神经丝轻链蛋白水平在阿尔茨海默病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、额颞叶痴呆、创伤性脑损伤等多种神经系统疾病的早期诊断、鉴别诊断、疾病进展监测和疗效评估中具有极高的临床价值，甚至可在临床症状出现前即反映神经损伤的存在。

2、目前，针对神经丝轻链蛋白的检测主要依赖于免疫学方法，包括酶联免疫吸附测定、电化学发光免疫分析、单分子阵列技术及磁微粒化学发光法等。然而，由于血液中神经丝轻链蛋白浓度较低，传统酶联免疫吸附法和普通化学发光免疫法的检测灵敏度受到限制，存在漏诊风险。

3、磁微粒化学发光免疫分析因兼具高灵敏度与免疫分析的高特异性，在生物分析领域展现出重要应用价值。但常规磁微粒化学发光试剂盒在磁珠包被过程中，抗体通过与磁珠偶联后，其活性位点常被遮蔽，导致有效捕获抗体密度不足，使得试剂盒实际检测灵敏度仍不理想。

技术实现思路

1、为了提高检测的灵敏度，本技术提供一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒及其检测方法。

2、第一方面，本技术提供一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒，采用如下的技术方案：

3、一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒，包括磁珠工作液10-30份和发光标记物40-60份，所述磁珠工作液的制备原料包括n-羟基琥珀酰亚胺-生物素、神经丝轻链蛋白单克隆抗体a、链霉亲和素磁性微球、封闭液和磁珠缓冲液，所述发光标记物的制备原料包括神经丝轻链蛋白单克隆抗体b、氨基化氧化石墨烯、盐酸多巴胺、吖啶琥珀酰亚胺酯、戊二醛、牛血清白蛋白和发光标记物缓冲液。

4、通过采用上述技术方案，本技术从信号端对发光标记物进行核心优化，并结合捕获端的亲和素-生物素放大系统，实现了检测灵敏度的显著提升。具体而言，发光标记物以氨基化氧化石墨烯作为信号放大载体。首先，盐酸多巴胺在弱碱性条件下于氨基化氧化石墨烯表面自聚合形成聚多巴胺薄膜，该薄膜富含邻苯二酚和氨基官能团，能够与戊二醛交联剂协同作用，为后续吖啶酯标记的抗体b提供丰富且均匀的共价结合位点。在此基础上，利用氧化石墨烯的高比表面积，单个纳米载体上可高效偶联大量抗体b分子，从而显著增加了单个发光标记物上有效发光分子的负载量，实现信号的指数级放大。此外，牛血清白蛋白的封闭处理有效封闭了载体上残余的非特异性结合位点，显著降低了检测背景信号。在捕获端，链霉亲和素磁性微球通过生物素-链霉亲和素系统高效捕获抗体a，进一步保证了目标抗原的有效富集，从捕获和检测两端协同提升信噪比，进而显著提高检测的灵敏度。

5、可选的，所述氨基化氧化石墨烯的制备步骤包括：将氧化石墨烯和去离子水混合，超声分散，加入乙二胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，室温反应，离心后去除上清液，洗涤，干燥，得氨基化氧化石墨烯。

6、通过采用上述技术方案，本技术通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化氧化石墨烯表面的羧基，并在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺催化下与乙二胺发生酰胺化反应，从而在氧化石墨烯表面引入大量氨基官能团。这些氨基一方面可增强氧化石墨烯在水相中的分散稳定性，另一方面为后续聚多巴胺薄膜的均匀沉积及戊二醛交联反应提供充足的活性锚点，进而为抗体b的高效固载奠定基础。同时，该反应在室温下进行，不引入强酸、强碱或高温处理，有效保持了氧化石墨烯片层的结构完整性，避免了片层堆叠团聚，有利于维持纳米载体的大比表面积优势。

7、可选的，所述氧化石墨烯的片径为100-300nm。

8、通过采用上述技术方案，本技术采用100-300nm片径的氧化石墨烯，在保证较大比表面积的同时，优化了边缘羧基和氨基官能团的空间可及性，有利于后续聚多巴胺薄膜的均匀修饰以及抗体b的高效偶联，从而确保单个纳米载体上能够负载足够的发光分子以实现信号放大。同时，该片径范围避免了粒径过大所导致的材料沉降速率加快和片层堆叠团聚问题，有利于维持发光标记物在溶液中的长期均匀分散性。

9、可选的，所述发光标记物的制备步骤包括：将氨基化氧化石墨烯和盐酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液混合，超声分散，加入盐酸多巴胺，搅拌均匀，加入戊二醛溶液，振荡活化，离心分离，重悬于磷酸盐缓冲液中，得分散液；将神经丝轻链蛋白单克隆抗体b和磷酸盐缓冲液混合，得抗体b混合液；将吖啶琥珀酰亚胺酯和n,n-二甲基甲酰胺混合，加入抗体b混合液，避光反应，通过透析袋分离纯化，然后加入分散液，搅拌均匀，加入牛血清白蛋白，封闭反应，离心分离，加入发光标记物缓冲液，得发光标记物。

10、更进一步地，所述发光标记物缓冲液的制备原料包括十二水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、牛血清白蛋白、proclin300抑菌剂和聚山梨醇酯-20。

11、可选的，所述磁珠工作液的制备步骤包括：将n-羟基琥珀酰亚胺-生物素加入到神经丝轻链蛋白单克隆抗体a中，培育，加入磷酸盐缓冲液后离心分离，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液，得生物素标记神经丝轻链蛋白单抗a；将链霉亲和素磁性微球使用磷酸盐缓冲液进行洗涤，磁性分离去除上清液，加入所述生物素标记神经丝轻链蛋白单抗a，混匀，然后加入封闭液进行封闭反应，反应完成后再次进行磁性分离去除上清液，加入磁珠缓冲液，得磁珠工作液。

12、更进一步地，所述磁珠缓冲液的制备原料包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、proclin300抑菌剂、聚山梨醇酯-20和牛血清白蛋白。

13、更进一步地，所述封闭液的制备原料包括牛血清白蛋白和盐酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液缓冲液。

14、可选的，所述磁珠工作液中的链霉亲和素磁性微球的浓度为0.1-1mg/ml，所述发光标记物中的神经丝轻链蛋白单克隆抗体b的浓度为0.01-5μg/ml。

15、通过采用上述技术方案，本技术将磁珠工作液中的链霉亲和素磁性微球的浓度控制在0.1-1mg/ml，将发光标记物中的神经丝轻链蛋白单克隆抗体b的浓度控制在0.01-5μg/ml，可使得捕获效率与信号放大效率相匹配，既避免了因捕获端过量而信号端不足所导致的信号稀释效应，也避免了因信号端过量而捕获端不足所导致的背景升高问题，从而实现最优的信噪比。

16、可选的，还包括校准品，所述校准品中神经丝轻链蛋白抗原的浓度为5-2000pg/ml。

17、通过采用上述技术方案，本技术校准品可为待测样本的准确定量提供了可靠的外标参照系，从而确保对临床样本中不同浓度水平的神经丝轻链蛋白均能实现精准定量检测。

18、可选的，还包括质控品，所述质控品中神经丝轻链蛋白抗原的浓度为50-1000pg/ml。

19、通过采用上述技术方案，本技术质控品可通过监控检测全过程的有效性，保障检测结果的准确性和可重复性。

20、第二方面，本技术提供一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒检测神经丝轻链蛋白的检测方法，采用如下的技术方案：

21、一种神经丝轻链蛋白检测试剂盒检测神经丝轻链蛋白的检测方法，包括以下步骤：

22、s1、取待测样本，加入所述磁珠工作液及所述发光标记物，混合均匀，孵育，磁性分离，清洗，得复合物；

23、s2、将所述复合物进行检测发光信号的强度，并计算得待测样本中的神经丝轻链蛋白的浓度。

24、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

25、1. 本技术从信号端对发光标记物进行核心优化，并结合捕获端的亲和素-生物素放大系统，实现了检测灵敏度的显著提升。具体而言，发光标记物以氨基化氧化石墨烯作为信号放大载体。首先，盐酸多巴胺在弱碱性条件下于氨基化氧化石墨烯表面自聚合形成聚多巴胺薄膜，该薄膜富含邻苯二酚和氨基官能团，能够与戊二醛交联剂协同作用，为后续吖啶酯标记的抗体b提供丰富且均匀的共价结合位点。在此基础上，利用氧化石墨烯的高比表面积，单个纳米载体上可高效偶联大量抗体b分子，从而显著增加了单个发光标记物上有效发光分子的负载量，实现信号的指数级放大。此外，牛血清白蛋白的封闭处理有效封闭了载体上残余的非特异性结合位点，显著降低了检测背景信号。在捕获端，链霉亲和素磁性微球通过生物素-链霉亲和素系统高效捕获抗体a，进一步保证了目标抗原的有效富集，从捕获和检测两端协同提升信噪比，进而显著提高检测的灵敏度；

26、2. 本技术通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化氧化石墨烯表面的羧基，并在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺催化下与乙二胺发生酰胺化反应，从而在氧化石墨烯表面引入大量氨基官能团。这些氨基一方面可增强氧化石墨烯在水相中的分散稳定性，另一方面为后续聚多巴胺薄膜的均匀沉积及戊二醛交联反应提供充足的活性锚点，进而为抗体b的高效固载奠定基础。同时，该反应在室温下进行，不引入强酸、强碱或高温处理，有效保持了氧化石墨烯片层的结构完整性，避免了片层堆叠团聚，有利于维持纳米载体的大比表面积优势。