一种基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条及其制备方法与应用

本发明属于食品领域，尤其是涉及一种基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条及其制备方法与应用。

背景技术：

1、食物过敏已成为全球范围内备受关注的公共卫生问题。水产品中虾、蟹等甲壳类动物作为重要的高蛋白食物来源，极易引发过敏反应，常伴随呼吸困难甚至致死性休克等临床症状。原肌球蛋白（tropomyosin, tm）是虾类中最主要且较为稳定的过敏原之一，即使经过加热、加工等处理后仍可能保留较强免疫原性。目前，临床上尚无有效治疗食物过敏的方法，严格避免摄入含过敏原食品是过敏人群唯一的预防途径。因此，对食品中tm过敏原的精准有效监测，是预防并降低食物过敏风险的有效途径。

2、目前，tm的检测方法主要包括仪器检测法、分子生物学检测及免疫学检测等方法。仪器分析法通常依赖大型仪器设备和复杂样品前处理过程，检测成本较高且难以满足现场快速检测需求；分子生物学方法虽然灵敏度较高，但检测周期较长，对实验条件和操作人员要求较高。相比之下，免疫分析法以其可行性高、成本低、特异性强及对操作人员专业要求低等优势，被视为食品过敏原检测领域极具潜力的解决方案。

3、胶体金免疫层析试纸条因其操作简便、检测快速、结果直观等优势受到了广泛的关注，成为现场快检的重要手段。然而，传统免疫层析试纸条多采用单克隆抗体或多克隆抗体作为识别元件，其制备周期长、成本高昂、批次间差异大导致试纸条效果有差异。更为关键的是，传统igg类抗体由于分子量大且结构复杂，对高温、酸碱等极端环境的耐受性较差，这导致由其制备的试纸条储存条件苛刻，货架期受到限制，难以适应食品检测现场复杂的环境条件。

4、纳米抗体（nanobody，nb）作为一种新型小分子抗体，来源于骆驼科动物重链抗体的可变区，具有分子量小（约15 kda）、稳定性高、亲和力强、易于工程化改造等优势，在免疫检测领域展现出巨大潜力。然而，目前将纳米抗体应用于免疫层析试纸条的研究仍处于起步阶段，尤其是针对虾原肌球蛋白检测的双纳米抗体夹心体系尚未见报道。因此，开发一种具有高灵敏度、高特异性、良好稳定性的双纳米抗体虾原肌球蛋白检测试纸条，对于食品过敏原的现场快速检测具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条及其制备方法与应用。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供了一种基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条，该试纸条包括信号载体和试纸条主体；

4、所述的信号载体为胶体金标记的虾原肌球蛋白纳米抗体nb78探针；

5、所述的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和衬板，所述的硝酸纤维素膜位于所述的衬板上，所述的硝酸纤维素膜的一端覆盖有所述的吸水垫，另一端覆盖有所述的结合垫，所述的结合垫的上方覆盖有样品垫；

6、所述的硝酸纤维素膜设置有检测线和质控线，所述的检测线和质控线相互平行，所述的吸水垫、结合垫分别位于所述的检测线和质控线的两侧；

7、所述的检测线包被有虾原肌球蛋白捕获纳米抗体nb48，所述的质控线包被有抗his标签抗体；所述结合垫上载有所述的信号载体。

8、进一步，所述的结合垫经封闭液进行封闭处理。

9、进一步，所述的纳米抗体nb48为的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述的信号载体中的纳米抗体nb78的氨基酸序列如seq id no.2所示。所述的纳米抗体nb48与纳米抗体nb78均来自申请号为2025108988900的中国发明专利，该专利申请日为2025-07-01。

10、本发明还提供了一种基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

11、（1）制备信号载体：在胶体金溶液中加入nb78纳米抗体，并采用牛血清白蛋白进行封闭处理，离心弃上清液后进行重悬沉淀，得到所述的胶体金标记的虾原肌球蛋白纳米抗体nb78探针；

12、（2）在硝酸纤维素膜上分别喷涂虾原肌球蛋白捕获纳米抗体nb48和抗his标签抗体，经干燥后形成检测线和质控线；

13、（3）制备结合垫：将聚酯膜浸入封闭液中，浸渍完成后进行干燥，然后将所述的胶体金标记的虾原肌球蛋白纳米抗体nb78探针载于干燥后的聚酯膜上，得到所述的结合垫；

14、（4）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜与吸水垫按液体迁移方向依次组装于衬板上，切割成条，装入卡壳后即成。

15、进一步，所述的步骤（1）中的胶体金溶液的ph值为8.5-9.5；所述的步骤（1）中的nb78纳米抗体在胶体金溶液中的终浓度为5-10 μg/ml；所述的步骤（1）中的牛血清白蛋白在胶体金溶液中的终浓度为1-2 w/v%；所述的步骤（1）中的重悬沉淀步骤使用pbs缓冲液。

16、进一步，所述的步骤（2）中的检测线中的虾原肌球蛋白捕获纳米抗体nb48的包被浓度为0.7-1.5 mg/ml，划线速率为0.8-1 μl/cm；所述的步骤（2）中的质控线中的抗his标签抗体的包被浓度为0.8-1 mg/ml，划线速率为0.8-1 μl/cm；所述的步骤（2）中的干燥步骤的温度为36-38 ℃，时间为2-4 h。

17、进一步，所述的步骤（3）中的封闭液包括如下重量份的组分：蔗糖2-6份，聚乙烯吡咯烷酮2-6份，脱脂奶粉1-3份，吐温的pbs缓冲液0.1-1份；所述的聚乙烯吡咯烷酮的分子量为8000-10000；所述的步骤（3）中的干燥步骤的温度为36-38 ℃，时间为4-8 h。

18、本发明还提供了一种使用检测试纸条检测虾原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：将待测样品溶液滴加至所述的样品垫上，层析后，观察检测线和质控线的显色情况；若检测线和质控线均显色，则结果为阳性，表明待测样品中含有虾原肌球蛋白；若质控线显色，且检测线不显色，则结果为阴性，表明待测样品中不含虾原肌球蛋白；若质控线不显色，则试纸条无效。

19、进一步，所述的检测线的显色强度与待测样品溶液中虾原肌球蛋白蛋白含量呈正相关；所述的层析步骤的时间为5-15 min。

20、本发明还提供了一种所述的基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条的应用，所述的试纸条在含虾食品的过敏原检测中的应用；所述的试纸条在虾原肌球蛋白的过敏原检测中的应用。

21、所述的试纸条的工作原理为：采用双纳米抗体夹心免疫层析原理。检测时，待测样品溶液中虾原肌球蛋白首先与胶体金标记的检测纳米抗体nb78结合形成复合物；该复合物继续层析至检测线时，所述的复合物在毛细作用下沿硝酸纤维素膜迁移，当迁移至检测线时，被固定于检测线上的捕获纳米抗体nb48捕获，从而在检测线形成可见色带；未被检测线截留的胶体金标记纳米抗体继续迁移至质控线，被抗his标签抗体捕获形成质控线色带；待测样品中含有虾原肌球蛋白时，检测线和质控线均显色；待测样品中不含有虾原肌球蛋白时，仅质控线显色；质控线不显色时，表明该试纸条无效。

22、纳米抗体nb48和纳米抗体nb78为两株能够分别特异性识别虾原肌球蛋白不同抗原表位的纳米抗体，二者可与待测样品中的虾原肌球蛋白形成夹心复合物。

23、相对于现有技术，本发明具有以下优势：

24、本发明所述的基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条首次将针对虾原肌球蛋白不同表位的双纳米抗体（nb78为检测探针、nb48为捕获抗体）配对应用于胶体金免疫层析试纸条中，形成双纳米抗体夹心体系。

25、本发明所述的基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条采用大肠杆菌产生的基因重组的纳米抗体作为识别元件，具有表达制备方便、稳定性较好、批次一致性较高及成本较低等优点。

26、本发明所述的基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条对虾原肌球蛋白的最低检测限（lod）低至0.42 ng/ml，能高灵敏度地捕获痕量虾原肌球蛋白，完全能够满足复杂食品中过敏原痕量残留的检测需求。

27、本发明所述的基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条采用的双纳米抗体nb78和nb48均针对虾原肌球蛋白的特异性表位筛选而得，能高度专一地识别目标过敏原，与蟹、贝类、鱼类等其他水产品的原肌球蛋白无任何交叉反应，有效排除了假阳性风险。

28、本发明所述的基于双纳米抗体的虾原肌球蛋白检测试纸条可用于多种食品基质样品中虾原肌球蛋白的快速检测，具有良好的实际应用价值。