一种基于氧化锌/银铜硫异质结的抗LGI1抗体检测方法

本发明属于光电化学生物传感，公开了一种基于氧化锌/银铜硫异质结的抗lgi1抗体检测方法。

背景技术：

1、光电化学生物传感技术结合了光电化学分析和生物识别技术，具有灵敏度高、响应速度快、设备简单等优点，在临床诊断领域具有广阔的应用前景。氧化锌（zno）作为一种宽带隙半导体材料（禁带宽度约3.37ev），具有良好的光电性能和生物相容性，但其仅响应紫外光区的特性限制了可见光利用率，且紫外光照射易引起生物分子降解。

2、为拓展zno的光响应范围，研究者尝试采用窄带隙半导体材料对zno进行敏化。现有技术中，已有将氧化锌反蛋白石（znoio）光子晶体结构用于光电化学生物传感的报道。例如，有研究以zno反蛋白石为基底，通过连续离子层吸附反应法沉积ag2s纳米颗粒，构建了用于甲胎蛋白检测的无标记光电化学免疫传感器。另有研究采用cds量子点敏化zno反蛋白石用于光电化学检测。然而，上述技术方案存在以下问题：（1）ag2s/znoio体系仅依赖单一的异质结增强机制，信号放大效果有限；（2）cds、pbs等材料含重金属毒性，生物相容性差，不利于商业化应用；（3）现有方案均未利用光子晶体慢光效应与异质结能带匹配的协同信号放大机制。

3、此外，在zno反蛋白石制备方面，已有专利公开了通过聚合物微球模板结合硝酸锌溶液渗透和高温煅烧制备zno反蛋白石结构的方法，但均仅涉及光催化应用，未涉及光电化学生物传感。在agcus材料方面，已有专利涉及ag@pt修饰cus的复合结构用于电化学免疫检测，但采用标记型检测模式，且材料为复合掺杂结构而非纯相三元agcus纳米晶。在抗lgi1抗体检测方面，现有方法主要依赖酶联免疫吸附测定（elisa）、细胞免疫荧光法等传统手段，存在操作繁琐、周期长、成本高、难以实现快速定量检测等问题。

4、综上所述，现有技术尚未将光子晶体慢光效应与半导体异质结能带匹配两种信号放大机制有机结合并应用于光电化学免疫检测，也缺乏针对抗lgi1抗体的无标记、快速、高灵敏光电化学检测方法。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术的不足，提供一种基于氧化锌/银铜硫异质结的抗lgi1抗体检测方法，旨在解决以下技术问题：（1）提供一种无毒、高可见光响应、高稳定性的光电化学电极材料，解决zno基光电材料的可见光利用瓶颈和重金属污染问题；（2）提供一种融合慢光效应与异质结能带匹配的双机制协同信号放大策略，突破现有单一信号放大机制的性能上限；（3）提供一种无标记、快速、高灵敏的自身免疫性脑炎相关抗体检测方法，解决传统检测方法的操作复杂性和时效性问题。

2、本发明所述的一种基于氧化锌/银铜硫异质结的抗lgi1抗体检测方法，包括以下步骤：

3、步骤一、制备单分散聚合物微球，通过垂直沉积自组装法在导电基底上组装聚合物胶体晶体模板；

4、步骤二、配制含锌盐的前驱体溶液，将所述前驱体溶液渗透至所述聚合物胶体晶体模板的间隙中，经煅烧去除聚合物模板，得到三维有序多孔结构的氧化锌反蛋白石层；

5、步骤三、在惰性气体保护下，将银盐、铜盐和硫源在有机溶剂中反应，合成银铜硫纳米晶；

6、步骤四、将所述银铜硫纳米晶负载于所述氧化锌反蛋白石层表面，经退火处理，得到氧化锌/银铜硫异质结电极；

7、步骤五、在所述氧化锌/银铜硫异质结电极表面修饰生物固定层，经双官能团交联剂活化后，用去离子水或缓冲液冲洗去除未反应的游离交联剂，得到活化电极；

8、步骤六、将lgi1抗原滴于活化电极表面，固定后用封闭剂封闭非特异性结合位点，得到传感电极；

9、步骤七、将待测样品溶液与所述传感电极接触孵育，在含有电子供体的电解液中，于恒电位和光照条件下测量光电流响应，根据光电流变化值定量检测待测样品中的抗lgi1抗体含量。

10、上述步骤一中，所述聚合物微球优选为聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）微球或聚苯乙烯（ps）微球；所述导电基底优选为亲水化fto导电玻璃；垂直沉积自组装后，在25～35℃陈化24～48小时，再在120～140℃烧结20～40分钟，得到聚合物胶体晶体模板。

11、上述步骤二中，所述锌盐优选为硝酸锌（zn(no3)2·6h2o）；所述前驱体溶液中还含有硅酸乙酯（teos）和柠檬酸或酒石酸，以改善溶液渗透效果；前驱体通过毛细作用渗透至模板间隙后，在空气气氛中煅烧3～5小时，优选4小时，得到氧化锌反蛋白石层；煅烧温度为400～500℃，优选450℃，升温速率为30～60℃/h；所述氧化锌反蛋白石层的孔径为500～1000nm。

12、上述步骤三中，所述银盐优选为硝酸银（agno3），所述铜盐优选为氯化铜（cucl2），所述硫源优选为硫代乙酰胺（taa），银、铜、硫的摩尔比优选为1:1:2；所述有机溶剂优选为油胺（ola）；所合成的银铜硫纳米晶为四方晶系单晶纳米晶（空间群cmc21），平均粒径为16～26nm。

13、上述步骤三中，银铜硫纳米晶的合成方法包括热注射法和水热/溶剂热法；所述热注射法步骤如下：

14、将硫源前驱体与油胺在氮气保护下加热至180～220℃形成透明硫源油胺溶液，依次快速注入含银盐油胺溶液和含铜盐油胺溶液，升温至210～230℃保持3～10分钟，经纯化后分散于甲苯或氯仿中；所述硫源油胺溶液中硫源前驱体浓度为0.2–0.6mmol，优选0.4mmol；所述含银盐油胺溶液中ag+浓度为0.1～0.3mmol，优选0.2mmol；所述含铜盐油胺溶液中cu2+浓度为0.1～0.3mmol，优选0.2mmol。

15、所述水热/溶剂热法步骤如下：

16、以银盐、铜盐和硫源为前驱体，在150～200℃水热或溶剂热反应6～24小时，获得银铜硫纳米晶。

17、上述步骤四中，所述银铜硫纳米晶的负载方式选自旋涂法、浸渍法或喷涂法中的任意一种；将银铜硫纳米晶分散液负载于氧化锌反蛋白石层表面，负载层数为3～7层，优选5层；退火温度为60～100℃，优选80℃，退火时间为1～3小时，优选2小时。当负载层数少于3层时，可见光敏化效果不足；5层信号质量最佳；当层数超过5层时，信号波形畸变加剧，检测稳定性和重现性下降；当层数达到7层时，信号质量进一步恶化且传质阻力显著增大。

18、上述步骤五中，所述生物固定层为壳聚糖（chitosan）或海藻酸钠；所述双官能团交联剂为戊二醛（glutaraldehyde）。

19、上述步骤六中，lgi1抗原的固定条件为：抗原浓度10～30μg/ml，优选20μg/ml，4℃孵育12–20小时，优选不低于15小时；所述封闭剂为牛血清白蛋白（bsa）、脱脂奶粉或鱼明胶，封闭条件为：封闭剂浓度0.5%～2%，35～40℃孵育0.5～2小时，优选以1%牛血清白蛋白在37℃封闭1小时。

20、上述步骤七中，将待测anti-lgi1抗体溶液滴加于传感电极表面，在35～40℃孵育1～2小时，优选37℃孵育1.5小时；采用标准三电极体系进行光电化学检测：工作电极为所述传感电极，参比电极为饱和甘汞电极（sce），对电极为铂丝电极；所述电子供体为抗坏血酸（aa），浓度为0.04～0.08m；所述电解液为ph6.5～7.5的磷酸盐缓冲液（pbs）；所述恒电位为0.5～0.7v（vs.sce）；光照采用500w氙灯或波长为500nm的led光源。

21、上述检测方法中，光电流变化值δi与抗lgi1抗体浓度c的对数呈线性关系：δi=a-b·lgc，其中a、b为与电极材料和检测体系相关的常数；在优选条件下，线性范围为0.01～500ng/ml，相关系数r2≥0.99，检测限为13pg/ml（s/n=3）。

22、本发明还提供一种用于实现上述检测方法的氧化锌/银铜硫异质结光电化学生物传感器，通过上述步骤1-6制得，结构包括：

23、导电基底；

24、设置于所述导电基底上的氧化锌反蛋白石层，所述氧化锌反蛋白石层具有三维有序多孔结构；

25、负载于所述氧化锌反蛋白石层表面和孔壁上的银铜硫纳米晶敏化层；

26、设置于所述银铜硫纳米晶敏化层表面的生物识别层，所述生物识别层包含通过交联剂共价固定的lgi1抗原以及封闭非特异性结合位点的封闭剂。

27、上述传感器的工作原理如下：氧化锌反蛋白石的三维有序大孔结构通过光子带隙边缘的慢光效应延长有效光程，增强光吸收效率；银铜硫纳米晶作为窄带隙敏化层，在可见光区具有高吸收系数，与氧化锌形成type-ii型能带匹配异质结，促进光生载流子有效分离、抑制复合。两种机制协同作用，实现信号的双重放大。当待测抗lgi1抗体与电极表面固定的lgi1抗原特异性结合后，免疫复合物的形成增加了表面空间位阻，阻碍电子供体向电极表面的扩散，导致光电流信号降低。光电流的降幅与抗lgi1抗体浓度呈定量关系，从而实现无标记定量检测。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

29、（1）材料体系创新。本发明采用无毒纯相三元硫族化合物银铜硫（agcus）纳米晶替代传统有毒重金属硫族化物（cds、pbs等）及二元ag2s，在保证优异光电性能的同时实现环境友好和生物相容性。

30、（2）双机制协同信号放大。本发明将氧化锌反蛋白石的慢光效应与银铜硫异质结的能带匹配相结合，实现约6倍的光电信号增强，该增强效果超出各自独立贡献的简单叠加，体现了协同增效作用。现有技术仅单独利用光子晶体结构效应或单独利用异质结敏化效应，尚未将二者协同应用于光电化学免疫检测。

31、（3）超灵敏宽线性范围检测。本发明的检测方法线性范围为0.01～500ng/ml（跨越5个数量级），检测限达13pg/ml，性能优于传统的elisa方法和多数已报道的光电化学传感器。

32、（4）无标记快速检测。本发明为直接无标记免疫检测，无需荧光、酶、纳米颗粒等信号标记物，操作步骤少、检测时间短（仅需约1.5小时），成本低、生物干扰小。

33、（5）优异的实际样本检测性能。人血清加标回收率为96%～105%，相对标准偏差（rsd）小于5.6%，对干扰蛋白具有高选择性，40天长期稳定性良好（4℃储存40天后保留初始响应的86%以上），具备临床诊断应用潜力。