一种用于血清样品中PEG-rhGH抗体和PEG抗体检测的方法与流程

本发明属于生物医药，涉及一种用于血清样品中聚乙二醇化重组人生长激素 （peg-rhgh）抗体和peg抗体检测的方法。

背景技术：

1、生长激素（growthhormone，gh）是一种垂体分泌源的蛋白质，参与调节生长发育过程中的代谢，其缺乏可以导致儿童生长发育迟缓，成人则为生长激素缺乏综合征。重组人生长激素（rhgh）可以纠正上述症状。为了延长半衰期，长效重组生长激素药物已成为目前生物技术药物的研发主流。

2、聚乙二醇化重组人生长激素（简称peg-rhgh），是一种长效生长激素，在临床治疗中，它们会产生免疫应答，引起不良免疫反应形成抗治疗物抗体（adas），即具有免疫原性。尽管长效生长激素药物进展迅速，但尚无检测其完整分子抗体的免疫定量方法，市售试剂盒仅检测rhgh抗体，无法区分peg-rhgh多结构域。又因血清中含有内源性gh和gh抗体，干扰全域蛋白抗体的检测；因此如何选择包被抗原和检测抗体，特异性检测识别peg-rhgh完整分子的抗体，反应peg-rhgh在体内的代谢情况是本领域研究的难点。因此，迫切需要建立灵敏、特异的peg-rhgh抗体检测方法，从而满足此类药物临床分析和评价需求。

3、抗体的检测通常应采用多层级分析方法，首先对所有样本进行筛选试验，之后对疑似抗体阳性样本的特异性进行确证试验，对已确证抗体阳性的样本进行滴度试验，以及对抗体中和活性进行检测。酶联免疫法因其快速、准确和试剂易获得性，成为抗体初步筛选/确证的首选方法。但是，在具体实施时，常常会由于试剂、材料、环境等因素，特别是待测样品中的一些干扰性物质会引起非特异性结合，导致有一定程度的假阳性，影响了检测结果的可信度。抗体的检测方法的关键在于：方法的特异性、灵敏度及检测通量等；亟需开发一种方法，提高检测的特异性和灵敏度，同时降低假阳率和假阴率，以满足监管要求和实际检测需求。

技术实现思路

1、基于elisa双抗原夹心法，利用“链亲和素和生物素”及“地高辛与地高辛抗体”的特异性结合，本发明提供了一种定性检测血清样品中peg-rhgh抗体和peg抗体的方法。

2、本发明通过将链亲和素（streptavidin）包被在酶标板上，生物素标记的聚乙二醇化重组人生长激素（peg-rhgh-biotin）与链亲和素结合捕获；待测样品与地高辛标记的peg-rhgh（peg-rhgh-digoxigenin）加入酶标板内进行共孵育，进一步与peg-rhgh-biotin结合捕获；加入抗-地高辛-pod标记，形成捕获抗原-检测抗体-报告抗体的复合物。

3、本发明采用两套经典生物亲和识别体系：链霉亲和素 - 生物素相互作用体系与地高辛 - 抗地高辛抗体免疫识别体系，经系统优化捕获抗原、报告抗体及反应浓度条件，显著改善检测性能，实现检测提速、通量提升与成本优化。本发明经过方法学评估，结果显示，特异性和精密度良好、灵敏度高、耐药性好，容易进行高通量检测，标准化操作和验证的特征，为满足长效生长激素药物临床分析和评价提供了一种技术手段。该方法通过使用标记生物素化的peg-rhgh和标记地高辛的peg-rhgh，可同时检测peg-rhgh抗体和peg抗体。

4、第一方面，提供一种用于血清样品中peg-rhgh抗体和peg抗体检测的方法，步骤如下：

5、s1：将链亲和素包被在酶标板上，得到包被后的酶标板；

6、s2：将生物素标记的聚乙二醇化重组人生长激素（peg-rhgh-biotin）加入包被后的酶标板中孵育结合，形成链亲和素结合peg-rhgh-biotin的复合物（抗原-生物素标记抗原复合物，记为streptavidin/peg-rhgh-biotin）；

7、s3：将待测样品和地高辛标记抗原（peg-rhgh-digoxigenin），加入s2所得酶标板内，进行共孵育结合，形成链亲和素结合生物素标记的peg化人生长激素-检测抗体-地高辛标记的peg化人生长激素的复合物（捕获抗原-检测抗体-报告抗原复合物，记为streptavidin/peg-rhgh-biotin/ada/peg-rhgh-digoxigenin）；

8、s4：将抗-地高辛-pod（anti-digoxigenin-pod）加入s3所得酶标板内，进行孵育结合，形成链亲和素结合生物素标记的peg化人生长激素-检测抗体-地高辛标记的peg化人生长激素-地高辛-pod的复合物（捕获抗原-检测抗体-报告抗原-报告抗体复合物，记为streptavidin/peg-rhgh-biotin/ada/peg-rhgh-digoxigenin/anti-digoxigenin-pod）；

9、s5：加入显色底物显色，添加终止反应液反应，测定od值，判定血清中待测样品的阴阳性，所述待测样品中含有peg-rhgh抗体和peg抗体。

10、在一些实施方式中，所述链亲和素用coating buffer稀释配制成浓度为1~10μg/ml的溶液，优选为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

11、在一些实施方式中，所述coating buffer为用0.5m na2co3和0.5m nahco3按1:(15~20)（v/v）充分混匀后用超纯水稀释10~15倍，制得，优选体积比为1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个，优选稀释为15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

12、在一些实施方式中，s1中，链亲和素100μl/well包板，包被在2~8℃ 600~800rpm过夜孵育12~16h，优选为12h、13h、14h、15h、16h以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个，优选为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

13、在一些实施方式中，s1中包被后，用洗液洗板后，加入封闭液室温孵育得到包被后的酶标板。在一些实施方式中，s1中包被后用洗液洗板后，加入封闭液室温600~800rpm，孵育1~3h得到包被后的酶标板。在本发明中，室温是指20~30℃，优选为25℃。在一些实施方式中，s1中所述洗液为0.1~0.5wt%chaps-pbs溶液。在一些实施方式中，s1中所述封闭液为1~5wt%bsa-tris-hcl溶液。

14、在一些实施方式中，所述生物素标记的聚乙二醇化重组人生长激素 （peg-rhgh）为peg-rhgh-biotin。

15、在一些实施方式中，所述生物素标记的peg化人生长激素的浓度为100~150ng /ml，优选为100ng /ml、110ng /ml、120ng /ml、130ng /ml、140ng /ml、150ng /ml以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，s2中所述孵育在140~180μl/well，优选为140μl/well、150μl/well、160μl/well、170μl/well、180μl/well以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个，室温，600~800rpm，孵育1~2h，优选为1h、1.5h、2h以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

16、在一些实施方式中，所述peg-rhgh-biotin的制备过程包括：将sulfo-nhs-lc-biotin溶液进行复溶，添加peg-rhgh和硼酸，进行生物素标记反应，孵育，经脱盐柱脱盐，收集得到。在一些实施方式中，sulfo-nhs-lc-biotin和peg-rhgh的摩尔比为(7~9):1，优选为7:1、8:1、9:1以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，peg-rhgh的浓度为5~5.5 mg/ml，优选为5 mg/ml、5.1 mg/ml、5.2 mg/ml、5.3 mg/ml、5.4mg/ml、5.5 mg/ml以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，peg-rhgh占反应总体积的15~50%，优选为15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，硼酸浓度为100~120mm，ph为8~8.5。在一些实施方式中，硼酸占反应总体积的46.5~82.5%，优选为46.5%、47%、48%、49%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、82.1%、82.2%、82.4%、82.5%以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，所述孵育在室温下孵育60~80分钟，优选为60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，sulfo-nhs-lc-biotin占反应总体积的1~5%，优选为1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

17、在一些实施方式中，s3中，所述待测样品加入量为200~250 μl/well，优选为200μl/well、210μl/well、220μl/well、230μl/well、240μl/well、250μl/well以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

18、在一些实施方式中，s3中，所述待测样品加入后，再加入地高辛标记抗原，进行共孵育。

19、在一些实施方式中，s3中，所述地高辛标记抗原为peg-rhgh-digoxigenin。在一些实施方式中，s3中，所述peg-rhgh-digoxigenin的浓度为100.0~150.0 ng /ml，优选为100.0ng /ml、110.0ng /ml、120.0ng /ml、130.0ng /ml、140.0ng /ml、150.0ng /ml以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，s3中，所述peg-rhgh-digoxigenin加入量为50~100 μl/well，优选为50μl/well、60μl/well、70μl/well、80μl/well、90μl/well、100μl/well以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，s3中，所述peg-rhgh-digoxigenin加入后，室温，600~800 rpm，共孵育1~5h。

20、在一些实施方式中，所述peg-rhgh-digoxigenin的制备过程包括：将dig-x-nhs溶液进行复溶，添加peg-rhgh和硼酸，进行地高辛标记反应，孵育，经脱盐柱脱盐，收集得到。在一些实施方式中，dig-x-nhs和peg-rhgh的摩尔比(7~9):1，优选为7:1、8:1、9:1以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，peg-rhgh的浓度为5~5.5mg/ml，优选为5 mg/ml、5.1 mg/ml、5.2 mg/ml、5.3 mg/ml、5.4 mg/ml、5.5 mg/ml以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，硼酸浓度为100~120mm，ph为8~8.5。在一些实施方式中，硼酸占反应总体积的45~75%，优选为45%、46%、46.5%、47%、48%、49%、50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、73.5%、74%、74.5%、75%以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，dig-x-nhs溶液的浓度为10~15mm，占反应体积的1.5~3.5%，优选为1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、2%、2.5%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，peg-rhgh占反应总体积的25~50%，优选为25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、46%、47%、48%、49%、50%以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

21、在一些实施方式中，s4中，所述抗-地高辛-pod抗体加入量为50~100μl/well，优选为50μl/well、60μl/well、70μl/well、80μl/well、90μl/well、100μl/well以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，s4中，所述抗-地高辛-pod抗体的浓度为0.05~0.1u/ml，优选为0.05u/ml、0.06u/ml、0.07u/ml、0.08u/ml、0.09u/ml、0.1u/ml以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，s3中，所述抗-地高辛-pod抗体加入后，室温，600~800 rpm，共孵育1~5h。在一些实施方式中，所述pod为hrp（辣根过氧化物酶）。

22、在一些实施方式中，所述待测样品为含待测样品的血清经稀释液稀释10~15倍后制得，优选为10倍。

23、在一些实施方式中，所述稀释液为0.5~1wt%bsa-pbs、0.5~1wt%bsa-0.05~0.1wt%t-pbs和1~1.5wt%bsa-0.1~0.5wt%chaps-pbs中至少一种，优选为0.5wt%bsa-pbs、0.5wt%bsa-0.05wt%t-pbs和1wt%bsa-0.1wt%chaps-pbs中至少一种。

24、在一些实施方式中，所述显色底物为tmb。

25、在一些实施方式中，所述显色底物添加量为150~180μl/well，优选为150μl/well、160μl/well、170μl/well、180μl/well以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。在一些实施方式中，所述显色反应在室温避光显色5~20min，优选为5min、10min、15min、20min以及以上数值中任意两个数值构成范围中的任意一个。

26、在一些实施方式中，所述终止反应液为2~2.5m h3po4。优选为2.5m h3po4。

27、在一些实施方式中，所述od值在450nm和620nm双波长下测定。620nm为参比波长，参比波长是用于校正检测信号中非特异性背景干扰的辅助波长，相当于一个无吸收背景信号，用于校正仪器干扰或者酶标板材质上的系统误差。

28、在一些实施方式中，所述待测样品的od值计算公式为：样品od=[（od450nm-od620nm）样品－（od450nm-od620nm）空白]。

29、在一些实施方式中，snr = mean (od 待测样本)/median (odncs)。

30、在一些实施方式中，筛选阶段，所述peg-rhgh抗体和peg抗体筛选临界值，snrscp按5%假阳性率计算，得snrscp=1.343。

31、在一些实施方式中，将待测样品检测值与筛选临界值（snrscp）进行比较和判定：

32、snr样品/snrscp≥1.00；判定为peg-rhgh抗体或peg抗体，筛选阳性；

33、snr样品/snr scp＜1.00；判定为peg-rhgh抗体或peg抗体，筛选阴性。

34、在一些实施方式中，筛选阳性样本进入确证阶段，所述待测样品的抑制率计算公式为：抑制率% = 100 %×（1–加药样本snr值/未加药样本snr值）。所述peg-rhgh抗体和peg抗体确证临界值ccp按1%假阳性率计算，ccp-peg-rhgh=28.56%，ccp-peg=39.97%。

35、在一些实施方式中，将待测样品检测值与确证临界值（ccp）进行比较和判定：

36、加抑制剂样品的抑制率＜ccp，判定为peg-rhgh抗体或peg抗体，确证阴性；

37、加抑制剂样品的抑制率≥ccp，判定为peg-rhgh抗体或peg抗体，确证阳性。

38、相对于现有技术，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点或有益效果：

39、本发明采用两套经典生物亲和识别体系：链霉亲和素 - 生物素相互作用体系与地高辛 - 抗地高辛抗体免疫识别体系，经系统优化捕获抗原、报告抗体及反应浓度条件，显著改善检测性能，在降低假阳、假阴性风险的同时，实现检测提速、通量提升与成本优化。本发明经过方法学评估，结果显示，特异性好，准确度和精密度良好，灵敏度高、耐药性好，容易进行高通量检测，标准化操作和验证的特征，为满足长效生长激素药物临床分析和评价提供了一种技术手段。该方法通过使用标记生物素化的peg-rhgh和标记地高辛的peg-rhgh，可同时检测peg-rhgh抗体和peg抗体。

40、本发明，①以人生长激素抗体为参考品：peg-rhgh抗体，灵敏度为10.1ng/ml。②以peg抗体为参考品：灵敏度为59.5ng/ml。