基于量子点荧光探针的微流控中和抗体检测方法及系统与流程

本发明涉及基于量子点荧光探针的微流控中和抗体检测方法及系统，属于生物检测。

背景技术：

1、病毒中和抗体的检测对于传染病诊断、疫苗免疫效果评价以及治疗性抗体开发具有重要意义。随着纳米技术与微流控技术的发展，基于量子点荧光探针的微流控检测技术因其高灵敏度、高通量及微型化优势，已成为免疫检测领域的研究热点。特别是利用量子点优异的光稳定性、高量子产率及宽斯托克斯位移，构建基于荧光共振能量转移（fret）的均相免疫检测体系，能够实现对抗原-抗体特异性结合过程的实时监测。

2、现有技术中，基于荧光共振能量转移的免疫分析方法主要侧重于稳态信号的测量，通常在激发后采集特定时间窗口内的荧光强度，计算供体与受体的荧光强度比值或fret效率作为定量依据。这种静态测量模式将荧光共振能量转移过程视为一种静态的物理状态，仅关注信号的瞬时强度变化，而忽略了在持续激发光照射下，荧光探针光物理性质随时间演化的动态过程。例如，在持续光照下，处于fret态的供体与未配对的供体往往表现出不同的光漂白动力学行为，这种时间维度上的差异信息在静态测量中被完全丢弃。

3、因此，上述现有技术存在的核心技术问题在于：仅将荧光共振能量转移效率作为静态量测量，未能利用荧光共振能量转移体系的时间演化动力学信息。这种信息缺失一方面导致检测动态范围受限于静态信噪比，且难以区分非特异性吸附产生的背景荧光，易受干扰；另一方面，由于缺乏动力学参数的内在约束，检测系统无法建立有效的自校验机制，难以识别探针聚集或环境波动引起的异常，限制了检测结果的准确性和可靠性。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于：提供基于量子点荧光探针的微流控中和抗体检测方法及系统，它解决了现有技术中仅将荧光共振能量转移效率作为静态量测量而未能利用体系时间演化动力学信息的问题，实现了对中和抗体的高精度、宽动态范围检测。

2、本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：

3、基于量子点荧光探针的微流控中和抗体检测方法及系统，包括以下步骤：

4、获取微流控芯片检测区域在持续激发光照射下的供体通道荧光信号时间序列；

5、对所述供体通道荧光信号时间序列进行双指数衰减拟合，得到第一衰减组分和第二衰减组分，其中，所述第一衰减组分对应第一速率常数和第一幅度，所述第二衰减组分对应第二速率常数和第二幅度；所述第一速率常数大于所述第二速率常数，所述第一幅度为负值；

6、计算所述第一幅度的绝对值与所述第二幅度的比值；

7、根据所述比值，通过预设的比值-表面覆盖度标定曲线确定所述检测区域的表面覆盖度；根据所述表面覆盖度与目标分析物浓度的预设负相关标定关系，确定待测样品中的目标分析物浓度。

8、可选地，所述获取供体通道荧光信号时间序列之前，还包括空间归一化步骤：

9、在所述持续激发光开启前，采集所述检测区域的初始荧光强度空间分布图；

10、在所述供体通道荧光信号时间序列的采集过程中，将所述检测区域中每个空间位置的实时荧光信号除以该空间位置在所述初始荧光强度空间分布图中对应的初始强度值，得到归一化荧光信号；

11、对所述归一化荧光信号进行空间平均，得到用于后续双指数衰减拟合的供体通道荧光信号时间序列。

12、可选地，所述持续激发光为经过光束匀光器整形的平顶分布光束，所述检测区域内的激发功率密度偏差不超过±5%。

13、可选地，所述双指数衰减拟合采用两步解耦拟合策略，具体包括：

14、对所述供体通道荧光信号时间序列的尾部时间段数据进行单指数拟合，确定所述第二速率常数和所述第二幅度；

15、根据所述第二速率常数和所述第二幅度计算衰减尾部基线，从所述供体通道荧光信号时间序列中扣除所述衰减尾部基线，得到残余信号；

16、对所述残余信号进行单指数拟合，确定所述第一速率常数和所述第一幅度。

17、可选地，所述第一幅度为负值由以下物理条件确定：受体荧光纳米探针的总漂白速率大于供体荧光纳米探针的本征漂白速率与单对fret效率的乘积，以使得与受体配对的供体以快于未配对供体的速率消失。

18、可选地，所述检测区域内固定有供体荧光纳米探针标记的固相识别元件，所述待测样品中还包含受体荧光纳米探针标记的标记结合体；所述目标分析物为中和抗体，所述中和抗体与所述标记结合体竞争结合所述固相识别元件，所述表面覆盖度表征所述检测区域上受体荧光纳米探针标记的标记结合体的结合量；所述供体荧光纳米探针的表面密度配置为使得供体-受体配对服从泊松分布且泊松参数不超过0.3。

19、可选地，所述供体荧光纳米探针通过刚性连接臂固定于所述固相识别元件上，所述受体荧光纳米探针通过柔性连接臂标记于所述标记结合体上；所述刚性连接臂与所述柔性连接臂的长度之和使得所述供体荧光纳米探针与所述受体荧光纳米探针之间的距离与预设förster半径的比值在0.8至1.2之间。

20、可选地，所述双指数衰减拟合之后，还包括模型有效性校验步骤：

21、构建单指数衰减模型和双指数衰减模型分别对所述供体通道荧光信号时间序列进行拟合；

22、通过f检验比较所述双指数衰减模型与所述单指数衰减模型的拟合优度，当所述f检验的统计量大于预设临界值时，确认所述双指数衰减模型有效。

23、可选地，还包括同步获取受体通道荧光信号时间序列，所述受体通道荧光信号时间序列包含第一受体衰减组分和第二受体衰减组分，所述第一受体衰减组分对应受体总漂白速率常数，所述第二受体衰减组分对应所述第一速率常数；

24、还包括动力学参数校验步骤和双通道交叉校验步骤；

25、所述动力学参数校验步骤包括：计算所述第一速率常数与所述第二速率常数的比值，判断所述比值是否落在预设的有效范围内，所述有效范围的下限为5，上限为检测体系的固有参数上限，所述固有参数上限由所述供体荧光纳米探针的本征漂白速率、所述受体荧光纳米探针的总漂白速率以及单对fret效率共同确定，且不随所述目标分析物浓度变化；若所述比值不在所述预设有效范围内则判定检测异常；

26、所述双通道交叉校验步骤包括：从所述受体通道荧光信号时间序列中提取所述第二受体衰减组分对应的速率常数，比较从所述供体通道荧光信号时间序列提取的所述第一速率常数与从所述受体通道荧光信号时间序列提取的所述第二受体衰减组分对应的速率常数的一致性，若差异超过预设阈值则判定检测异常。

27、一种基于量子点荧光探针的微流控中和抗体检测系统，包括：

28、微流控芯片，具有检测区域，所述检测区域内固定有供体荧光纳米探针标记的固相识别元件，所述供体荧光纳米探针的表面密度配置为使得供体-受体配对服从泊松分布且泊松参数不超过0.3；

29、光学激发模块，用于在所述检测区域产生功率密度均匀分布的持续激发光；

30、荧光检测模块，用于同步采集供体通道荧光信号时间序列和受体通道荧光信号时间序列；

31、数据处理模块，用于上述方法，对所述供体通道荧光信号时间序列进行处理并输出目标分析物浓度。

32、本发明的有益效果是：通过获取持续激发光照射下的供体通道荧光信号时间序列，利用双指数衰减拟合提取出反映fret动力学过程的快衰减组分（第一衰减组分）与反映本征漂白的慢衰减组分（第二衰减组分），并创新性地利用快组分的负幅度绝对值与慢组分幅度的比值作为定量指标。该方法充分利用了fret体系的时间演化动力学信息，建立了比值与表面覆盖度的直接关联，有效拓宽了检测动态范围。此外，该方法还通过动力学参数比值的有效范围校验以及双通道速率常数的一致性交叉校验，构建了完善的检测自校验体系，显著提升了检测系统在复杂样本环境中的抗干扰能力和结果可靠性。