一种降钙素原测定试剂盒及其制备与检测方法与流程

本发明涉及体外诊断试剂及免疫分析检测，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法对血清或血浆中的降钙素原进行定量检测的试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、降钙素原（procalcitonin,pct），是降钙素的一种前体物，在正常情况下是由甲状腺c细胞所分泌；在机体受到细菌、真菌或者寄生虫等感染特别是受到细菌感染引起的促炎症反应刺激下，许多不同器官和组织均可产生pct，使得血液中pct浓度增加，因为pct的浓度与全身感染以及脓毒症的发生和严重程度有一定相关关系而经常用来对感染和不明原因发热进行辅助诊断、对脓毒症早识别并跟踪治疗过程中监控，同时可以作为抗生素使用和停用的参考依据。相对于血培养而言，pct检测所需要的时间更少且采血量也较小，比较适用于临床快速检测。

2、目前常见的pct检定方法有：化学发光免疫分析、荧光免疫分析和胶乳增强免疫比浊法三种方式，其中，胶乳增强免疫比浊法则可以在全自动生化分析仪上进行检测，具备方便快捷的特点，检测速度快并且仪器适应性强等特点。一般采用抗pct抗体偶联到胶乳颗粒表面，样品中的pct与敏化的胶乳发生免疫聚集作用，进而测量反应液吸光度的变化来判断pct浓度大小。

3、但是现有的抗体胶乳试剂多数是使用单一抗体敏化的密度或者不同的粒径胶乳颗粒，在抗体敏化密度过低的情况下不能很好地捕获低浓度pct的情况，而当抗体敏化密度过高的时候又容易出现颗粒间的快速聚集以及高浓度区响应被压缩的现象，并且非特异背景会随之升高；采用不同粒径批次胶乳进行复配的时候由于胶乳颗粒自身的沉降速度、表面曲率以及聚集的动力学的不同，容易引起批间的一致性问题以及储存不稳定的问题。同时，像聚乙二醇这类促凝成分虽然是可以加快免疫聚集反应的速度，但是在用量或体系组成不合适的情况也可能会促进非特异聚集从而造成空白吸光度升高和低值检测结果波动现象的发生。敏化胶乳在液态储存的过程中还会发生抗体构象的变化、颗粒融合或是沉降等情况，而在参考校准品方面也可能会出现pct活性下降、冻干品复溶不完全以及赋值稳定性不够等问题的存在。所以需要提供一种能兼顾低浓度检测灵敏度、宽测量区间、检测精密度以及储存稳定的降钙素原测定试剂盒。

技术实现思路

1、本发明针对上述缺陷，提供一种降钙素原测定试剂盒，包括分开储存的反应调节试剂r1、抗体胶乳试剂r2和参考校准品；

2、所述反应调节试剂r1包括第一缓冲体系、氯化钠、聚乙二醇6000、l-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮k30、乙二胺四乙酸二钠、第一非离子表面活性剂、第一防腐剂和水；

3、所述抗体胶乳试剂r2包括第二缓冲体系、第一敏化胶乳、第二敏化胶乳、海藻糖、泊洛沙姆188、牛血清白蛋白、第二防腐剂和水；所述第一敏化胶乳和第二敏化胶乳分别由抗人降钙素原多克隆抗体偶联于两部分羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒形成，所述两部分羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒由同一生产批次的胶乳颗粒分散液经充分混匀后分取得到；所述第一敏化胶乳与第二敏化胶乳的平均粒径之比为0.90～1.10，第一敏化胶乳中单位质量胶乳颗粒的抗体结合量为第二敏化胶乳的1.5倍～4.0倍；二者按胶乳颗粒干重计的质量比为1:2～2:1，所述抗体胶乳试剂r2中胶乳颗粒按干重计的质量体积百分浓度为0.25%；

4、所述参考校准品包括重组降钙素原、第三缓冲体系、牛血清白蛋白、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、第三防腐剂和水，并以冻干形式保存。

5、进一步地，所述反应调节试剂r1包括20mmol/l～100mmol/l的hepes、50mmol/l～200mmol/l的氯化钠、10g/l～50g/l的聚乙二醇6000、5mmol/l～30mmol/l的l-精氨酸、1g/l～10g/l的聚乙烯吡咯烷酮k30、0.5mmol/l～5mmol/l的乙二胺四乙酸二钠、0.1g/l～1.0g/l的第一非离子表面活性剂以及体积分数为0.03%～0.10%的第一防腐剂，ph值为7.2～8.0。

6、进一步地，所述聚乙二醇6000与聚乙烯吡咯烷酮k30的质量比为5:1～10:1，所述l-精氨酸的终浓度为10mmol/l～20mmol/l；所述第一非离子表面活性剂为吐温-20，所述第一防腐剂为proclin 300，所述反应调节试剂r1的ph值为7.4～7.8。

7、进一步地，所述羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为100nm～180nm，粒径变异系数不大于10%；所述第一敏化胶乳和第二敏化胶乳中单位质量胶乳颗粒的抗体结合量分别为100μg/mg～200μg/mg和30μg/mg～90μg/mg，且二者之比为1.5:1～4.0:1；所述抗体结合量按投料抗体量与偶联后上清液中未结合抗体量之差计算。

8、进一步地，所述抗体胶乳试剂r2包括10mmol/l～50mmol/l的hepes、10g/l～50g/l的海藻糖、0.5g/l～5g/l的泊洛沙姆188、1g/l～10g/l的牛血清白蛋白以及体积分数为0.03%～0.10%的第二防腐剂；所述第二防腐剂为proclin 300，所述抗体胶乳试剂r2的ph值为7.0～7.8。

9、进一步地，所述参考校准品包括降钙素原浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml的六个浓度水平；冻干前的参考校准品包括10mmol/l～50mmol/l的tris-hcl、5g/l～30g/l的牛血清白蛋白、20g/l～80g/l的海藻糖、10g/l～50g/l的甘露醇、5g/l～30g/l的甘氨酸以及体积分数为0.03%～0.10%的第三防腐剂；所述第三防腐剂为proclin 300，冻干前的ph值为7.2～7.6。

10、本技术还提供一种如上所述降钙素原测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

11、s1：将第一缓冲体系、氯化钠、聚乙二醇6000、l-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮k30、乙二胺四乙酸二钠、第一非离子表面活性剂、第一防腐剂和水混合并调节ph值，得到反应调节试剂r1；

12、s2：将同一粒径批次的羧基化聚苯乙烯胶乳原料，按胶乳颗粒干重计量后分取为两部分，分别采用不同抗体投料量偶联抗人降钙素原多克隆抗体，得到第一敏化胶乳和第二敏化胶乳；经封闭、离心去除上清液并重悬后，将二者按胶乳颗粒干重计以1:2～2:1的质量比混合，加入第二缓冲体系、海藻糖、泊洛沙姆188、牛血清白蛋白和第二防腐剂，将胶乳颗粒的质量体积百分浓度调整为0.25%，得到抗体胶乳试剂r2；

13、s3：将重组降钙素原、第三缓冲体系、牛血清白蛋白、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、第三防腐剂和水混合，过滤后冻干，得到参考校准品。

14、进一步地，在步骤s2中，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺活化羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒；制备第一敏化胶乳和第二敏化胶乳时，抗人降钙素原多克隆抗体与胶乳颗粒按干重计的投料质量比分别为1:(4～8)和1:(10～30)，偶联温度为20℃～25℃，偶联时间为2h～4h，偶联后采用牛血清白蛋白封闭。

15、进一步地，在步骤s2中，所述第一敏化胶乳和第二敏化胶乳分别在10000×g～20000×g的相对离心力下离心20min～40min，并采用含有第二缓冲体系、海藻糖、泊洛沙姆188、牛血清白蛋白和第二防腐剂的重悬液进行重悬；

16、在步骤s3中，将参考校准品在-60℃～-40℃下预冻2h～6h，在10pa～30pa的真空度及-30℃～-10℃的隔板温度下干燥8h～16h，再在15℃～25℃下干燥2h～6h。

17、本技术还提供一种采用如上所述降钙素原测定试剂盒的降钙素原检测方法，包括以下步骤：

18、t1：按照待测样品与反应调节试剂r1的体积比为1:30～1:80，将二者混合并在37℃下孵育1min～3min，在570nm～700nm范围内选定检测波长并读取初始吸光度；

19、t2：按照反应调节试剂r1与抗体胶乳试剂r2的体积比为3:1～6:1加入抗体胶乳试剂r2，在37℃下反应2min～5min，并在同一检测波长下读取反应吸光度；

20、t3：根据反应吸光度与初始吸光度的差值及参考校准品建立的校准曲线，确定待测样品中的降钙素原浓度。本技术具有以下有益效果：

21、与现有技术相比，本发明将同一生产批次的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒分散液充分混匀后分取为两部分，使两部分胶乳颗粒在抗体偶联前具有相同的原料来源，并使其初始平均粒径、粒径分布、表面羧基状态及分散状态在统计意义上保持一致，从而降低不同生产批次胶乳颗粒在沉降行为和免疫聚集动力学方面的差异。在此基础上，通过不同抗体投料量分别形成具有不同抗体结合量的第一敏化胶乳和第二敏化胶乳，利用较高敏化密度胶乳增强低浓度pct捕获能力，并利用较低敏化密度胶乳缓解高浓度区的快速聚集和响应压缩，从而兼顾检测灵敏度、线性测量区间及重复性。同一生产批次，是指两部分羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒取自具有相同生产批号的胶乳颗粒原料；同一生产批次不要求两部分胶乳颗粒在敏化后具有完全相同的平均粒径，而是表示两部分胶乳颗粒在抗体偶联前具有相同的原料来源和一致的初始粒径分布基础。利用较高敏化密度胶乳增强低浓度pct捕获能力，并利用较低敏化密度胶乳缓解高浓度区的快速聚集和响应压缩，从而兼顾检测灵敏度、测量区间及重复性；反应调节试剂r1中的聚乙二醇6000促进抗原抗体复合物聚集，反应调节试剂r1中的聚乙二醇6000通过排除体积效应提高抗原与抗体发生有效碰撞并形成特异性免疫聚集体的概率。l-精氨酸能够与抗体表面的带电残基及芳香残基发生可逆作用，减弱抗体分子之间以及抗体与样品杂质之间的非特异性相互作用；聚乙烯吡咯烷酮k30作为亲水性非离子聚合物，能够提高胶乳颗粒界面的水化程度并形成空间位阻屏障，降低未由pct桥联的胶乳颗粒直接接触及非特异絮凝的概率。l-精氨酸与聚乙烯吡咯烷酮k30共同限制聚乙二醇6000引起的非特异性促聚集，使体系在促进pct介导的抗原-抗体特异性聚集的同时抑制非抗原介导的背景聚集，从而降低空白样品的吸光度变化，并减小低浓度样品的检测波动。抗体胶乳试剂r2中的海藻糖、泊洛沙姆188和牛血清白蛋白分别发挥抗体构象保护、空间位阻分散及封闭稳定作用，可减缓敏化胶乳在液态储存过程中的颗粒融合和活性降低；参考校准品采用牛血清白蛋白、海藻糖、甘露醇和甘氨酸构成复合冻干保护体系，有利于形成稳定冻干骨架、降低残余水分并改善复溶性能，进而保持pct校准品的赋值稳定性。该试剂盒可适配全自动生化分析仪，操作步骤简便，能够缩短检测时间并提高检测结果的可靠性。