用于IHC信号放大的二抗-水凝胶-HRP复合物及其制备方法与流程

本发明属于免疫组化，具体涉及一种用于ihc信号放大的二抗-水凝胶-hrp复合物及其制备方法。

背景技术：

1、免疫组织化学（ihc）染色技术是临床病理诊断中抗原定位与定量检测的核心手段，二抗偶联辣根过氧化物酶（hrp）的信号放大体系，是决定ihc检测灵敏度与准确性的关键核心。

2、市面上主流的二抗-hrp信号放大方案主要分为三类：其一，直接标记法，通过戊二醛、smcc等化学交联剂将hrp直接偶联至二抗分子，工艺简单、成本低廉，但每个二抗仅能偶联1-3个hrp，信号强度有限，仅适用于高丰度抗原检测；其二，生物素-链霉亲和素介导法，构建“生物素化二抗-链霉亲和素-hrp”三级体系，利用链霉亲和素与生物素的高亲和力实现信号放大，灵敏度较直接标记法提升5-10倍，但受组织内源性生物素干扰易产生非特异性染色，需额外增加封闭步骤，操作复杂度高；其三，聚合物介导法，以葡聚糖、聚酰胺-胺树枝状大分子等为支架，同时偶联二抗与多个hrp，hrp负载量提升至5-20个/二抗，是中高灵敏度ihc的核心方案，但支架分子量过大、结构松散，导致复合物空间位阻显著，阻碍二抗与一抗结合并降低组织穿透性，且载体表面活性位点多，易发生非特异性吸附，背景干扰严重。现有水凝胶相关技术在免疫检测中的应用，多聚焦于elisa平台的酶标抗体包封释放，并非针对二抗-hrp的定向高负载与信号放大。

3、现有技术中hrp负载量与空间位阻冲突、背景干扰严重、ihc适配性不足，因此，亟需开发一种兼具高hrp负载量、低背景、适配ihc流程的信号放大复合物。

技术实现思路

1、为了解决上述问题中的至少一种，本发明提供了一种用于ihc信号放大的二抗-水凝胶-hrp复合物及其制备方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：

3、本发明的第一方面提供了用于ihc信号放大的二抗-水凝胶-hrp复合物，所述复合物包括‌水凝胶共价支架以及定向偶联的二抗和多个hrp。

4、在本发明的一些实施方案中，所述水凝胶共价支架为酪胺酚基化‌水凝胶共价支架。

5、在本发明的一些实施方案中，所述二抗为多克隆抗体，多克隆抗体为羊抗兔和/或羊抗鼠多抗。在本发明的一些实施方案中，一个二抗上偶联1-2个水凝胶共价支架；水凝胶共价支架上定向偶联20-50个hrp，作为其中一种实施方案的优选，水凝胶共价支架上定向偶联30-40个hrp。

6、在本发明的一些实施方案中，酪胺酚基化‌水凝胶的制备包括如下步骤：

7、s1、将低分子量壳聚糖溶于mes缓冲液中得到壳聚糖溶液；将酪胺盐酸盐加入上述溶液中搅拌，加入edc和nhs，室温避光反应后，转入透析袋中，透析后溶液冷冻干燥，得到酪胺酚基化‌壳聚糖固体；

8、s2、将步骤s1中制备得到的酪胺酚基化‌壳聚糖固体溶于mes缓冲液，得到酪胺酚基化‌壳聚糖溶液；向酪胺酚基化‌壳聚糖溶液中加入hrp溶液和h2o2溶液，快速混匀后，室温避光反应后离心，弃上清，用pbs缓冲液洗涤多次，得到酪胺酚基化‌水凝胶。

9、在本发明的一些实施方案中，酪胺酚基化‌水凝胶的制备还包括对酪胺酚基化‌水凝胶进行活化，步骤如下：将步骤s2中得到的酪胺酚基化‌水凝胶用pbs重悬制备成水凝胶悬液，加入edc/nhs混合液，混匀，4℃避光恒温摇床反应，活化反应结束后离心，弃上清，用pbs缓冲液洗涤多次，用pbs重悬。

10、本发明的第二方面提供了用于ihc信号放大的二抗-水凝胶-hrp复合物的制备方法，包括如下步骤：

11、s1、制备酪胺酚基化‌壳聚糖

12、将低分子量壳聚糖溶于mes缓冲液，磁力搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；将酪胺盐酸盐加入上述溶液中搅拌，加入edc和nhs，室温避光反应后，转入透析袋中透析后溶液冷冻干燥，得到酪胺酚基化‌壳聚糖固体；

13、s2、制备酪胺酚基化‌水凝胶

14、将步骤s1中制备得到的酪胺酚基化‌壳聚糖固体溶于mes缓冲液，磁力搅拌至完全溶解，得到酪胺酚基化‌壳聚糖溶液；向酪胺酚基化‌壳聚糖溶液中加入hrp溶液和h2o2溶液，快速混匀后，室温避光反应后离心，弃上清，用pbs缓冲液洗涤多次，去除游离hrp和未反应底物，得到酪胺酚基化‌水凝胶；

15、s3、制备活化型酪胺酚基化‌壳聚糖水凝胶

16、将步骤s2中得到的酪胺酚基化‌水凝胶用pbs重悬制备成水凝胶悬液，加入edc/nhs混合液，混匀，4℃避光恒温摇床反应，活化反应结束后离心，弃上清，用pbs缓冲液洗涤多次，去除多余交联剂，用pbs重悬，得到活化型酪胺酚基化‌壳聚糖水凝胶；

17、s4、制备水凝胶-hrp复合物

18、将步骤s3中得到的活化型酪胺酚基化‌壳聚糖水凝胶用pbs重悬制备成水凝胶悬液，加入hrp溶液混匀，4℃避光恒温摇床反应，向反应液中加入乙醇胺溶液，4℃反应后超速离心，弃上清，用pbs缓冲液洗涤多次，得到水凝胶-hrp复合物；

19、s5、制备二抗-水凝胶-hrp复合物

20、将步骤s4中得到的水凝胶-hrp复合物用pbs重悬制备成水凝胶-hrp复合物悬液,加入smcc溶液，混匀，4℃避光反应，活化水凝胶表面氨基；加入还原二抗溶液，4℃避光恒温摇床反应，使二抗巯基与水凝胶表面活化氨基通过smcc形成稳定硫醚键；向反应液中加入bsa封闭液，4℃反应，终止偶联，即得到二抗-水凝胶-hrp复合物。

21、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s3中，edc/nhs混合液的配制方法为：在mes缓冲液中溶解edc和nhs，edc和nhs的终浓度分别为0.1 mol/l、0.2 mol/l，磁力搅拌至完全溶解。

22、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s4中，活化型酪胺酚基化‌壳聚糖水凝胶与hrp的摩尔比为1：（25-50）。

23、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s5中，水凝胶-hrp与二抗的摩尔比为（1-2）：1。

24、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s2、s3和s4中离心的条件为：10000-12000rpm、4℃离心20-25 min。

25、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s5中，还原二抗溶液的制备方法如下：取山羊抗兔/山羊抗鼠igg二抗，加入dtt溶液，37℃水浴反应，还原二抗铰链区二硫键，暴露游离巯基；将还原后的二抗溶液转入透析袋，截留分子量10 kda，用pbs缓冲液4℃透析，去除未反应的dtt，透析后用od280nm吸光度法定量，调整二抗浓度至1mg/ml，4℃避光备用。

26、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s1中，透析袋截留分子量3.5kda。

27、在本发明的一些实施方案中，所述步骤s3、s4、s5中，恒温摇床的转速为60-80rpm。

28、本发明的第三方面提供了用于ihc信号放大的二抗-水凝胶-hrp复合物在制备免疫组化检测试剂盒中的应用。

29、本发明还提供一种免疫组化检测试剂盒，所述试剂盒中包含第一方面所述的或者采用第二方面所述方法制备得到的用于ihc信号放大的二抗-水凝胶-hrp复合物。

30、本发明的有益效果

31、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

32、本技术以纳米多孔酪胺酚基化‌水凝胶为共价支架，将多个hrp（20-50个）与二抗定向偶联，形成了专用于ihc染色、可一步孵育的高灵敏度低背景信号放大复合物，该复合物中水凝胶经定向活化修饰，主要保留与二抗、hrp结合的特异性活性位点，避免内源性生物素干扰与载体非特异性结合产生背景；水凝胶多孔结构高负载量、低空间位阻优于现有方案；是一款兼具高灵敏度、高特异性、高稳定性、高适配性的新型ihc信号放大试剂，可替代市售二抗，尤其适用于肿瘤标志物低丰度表达、肿瘤微小转移灶检测等临床难点场景，具备极高的临床转化与产业应用价值；且其制备工艺简单可控，兼容现有ihc设备与临床流程，可规模化生产。