基于PCT、MxA和CD64联合检测的感染类型快速鉴别试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种基于pct、mxa和cd64联合检测的感染类型快速鉴别试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、急性呼吸道感染是临床最常见的感染性疾病，早期精准鉴别细菌感染、重症细菌感染与病毒感染，对指导临床合理用药、降低抗生素滥用率、改善患者预后具有重要意义。目前临床单一感染标志物均存在性能局限：pct 是重症细菌感染 / 脓毒症的金标准标志物，但感染发病 6 小时内灵敏度不足；mxa 是病毒感染高特异性标志物，但属于白细胞胞内蛋白，需裂解细胞释放后检测；中性粒细胞 cd64 是细菌感染早期最灵敏的指标之一，但其天然存在于中性粒细胞膜表面，金标准检测依赖流式细胞术，无法适配免疫层析平台。

2、目前开发mxa/pct/cd64联合检测试剂盒面临如下主要问题：一、mxa是人体内含量可达上百ng/ml的蛋白，与要求检测灵敏度为几pg/ml的cd64在一个层析系统中被共同检测，既要求mxa稀释倍数高又要求不能太高，否则cd64的检测灵敏度无法达到要求，这对原料及工艺存在一定挑战；二、pct和mxa均为可溶性小分子蛋白，而 cd64 作为中性粒细胞膜表面的跨膜糖蛋白，在释放或以膜碎片/裂解形式存在于血液中时，常呈现出空间立体结构复杂、抗原表位隐蔽的特点。当采用表面直接偶联抗体的常规微球时，抗体结合位点紧贴微球固相表面，空间位阻效应显著，导致抗体与 cd64 膜蛋白表位的有效接触受限，严重制约了试剂盒对细菌感染早期识别的灵敏度和准确性；三，微球在复杂样本基质中的非特异性吸附与团聚问题突出。常规羧基化荧光微球表面疏水区域较多，在检测全血、血浆等复杂生物样本时，容易与血清中的杂蛋白、脂质等发生非特异性吸附，同时大粒径微球之间也容易发生自我团聚。这些问题导致检测背景噪声升高、批间差异增大，试剂的重复性和稳定性难以满足临床检测的严格要求。

3、因此，开发一个敏感、特异、可分辨细菌和病毒感染的标志物，制备出能正确指导临床抗生素的使用和抗病毒治疗的试剂盒，这对于感染诊断和治疗具有极大的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供基于pct、mxa和cd64联合检测的感染类型快速鉴别试剂盒及其制备方法，该试剂盒可实现同时对pct、mxa和cd64三种标志物的定量检测，能够精准鉴别细菌感染与病毒感染，解决了现有联合检测中不同丰度靶标检测灵敏度难以兼顾、大尺寸靶标捕获效率低、微球非特异性吸附强的技术问题。本发明的试剂盒操作简便，检测快速，能够辅助临床快速鉴别细菌感染与病毒感染，为合理使用抗生素提供精准的检测依据。

2、具体而言，第一方面，本发明提供如下技术方案：

3、基于pct、mxa和cd64联合检测的感染类型快速鉴别试剂盒，包括荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、nc膜、 吸水垫和底板，所述结合垫上设置有第一荧光微球-pct标记抗体复合物、第二荧光微球-mxa标记抗体复合物和第三荧光微球-cd64标记抗体复合物；

4、所述nc膜上沿样本层析流动方向依次设置有t1检测线、t2检测线、t3检测线和质控线，所述t1线上具有cd64包被抗体，所述t2线上具有mxa包被抗体，所述t3线上具有pct包被抗体，所述质控线包被羊抗鼠 igg 抗体；

5、其中第一荧光微球和第二荧光微球表面接枝的聚乙二醇间隔臂的分子量小于第三荧光微球表面接枝的聚乙二醇间隔臂的分子量；在接枝有聚乙二醇间隔臂的所述第一荧光微球、第二荧光微球和第三荧光微球上，还接枝有由磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯形成的磺酸甜菜碱型两性离子基团，且所述第一荧光微球、第二荧光微球和第三荧光微球的表面还保留有羧基活性位点。

6、作为优选的技术方案，第一荧光微球的平均粒径为60~80nm，所述第二荧光微球的平均粒径180~200nm、所述第三荧光微球的平均粒径为400~450nm。

7、上述技术方案中，三种荧光微球的粒径梯度、peg间隔臂分子量差异以及磺酸甜菜碱型两性离子基团的接枝协同发挥作用。第一荧光微球用于标记 pct 抗体，其粒径较小，单个微球的荧光强度较低，有利于抑制高浓度 pct 样本的钩状效应，拓宽线性范围上限；第二荧光微球用于标记 mxa 抗体，其粒径居中，提供适中的荧光强度，与 mxa 的临床检测区间相匹配；第三荧光微球用于标记 cd64 抗体，其粒径较大，可容纳较多荧光物质，单颗粒荧光信号较强，有利于提高对 cd64 膜蛋白标志物的检测信噪比；同时，第三荧光微球表面接枝的 peg 间隔臂分子量较大，能够将抗体结合位点向外有效延伸，为空间立体结构复杂、抗原表位隐蔽的 cd64 靶标结合提供更充裕的空间，减小空间位阻对捕获效率的影响。三种微球表面接枝的磺酸甜菜碱型两性离子基团可形成稳定水化层，有助于降低样本基质中杂蛋白的非特异性吸附，并抑制大粒径微球的自我团聚；表面保留的适量羧基活性位点则用于抗体的稳定共价偶联。

8、作为优选的技术方案，所述第一荧光微球的发射波长450nm，第二荧光微球发射波长 525nm，第三荧光微球发射波长 615nm。

9、上述技术方案中，可使三种荧光微球的发射波长互不干扰，检测仪器可通过不同波长通道分别读取三条检测线的荧光信号，实现三种标志物的同时定量检测，避免不同荧光信号之间发生串扰，保障检测结果的准确性。

10、作为优选的技术方案，所述第一荧光微球和第二荧光微球表面接枝的聚乙二醇间隔臂分子量为2kda；所述第三荧光微球表面接枝的聚乙二醇间隔臂分子量为10kda。

11、作为优选的技术方案，所述第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球的表面分别保留的羧基活性位点，占微球表面原有总羧基位点的10%～15%。

12、作为优选的技术方案，所述t1检测线上cd64抗体的包被浓度为1.5～2.5mg/ml，所述t2检测线上mxa抗体的包被浓度为1.0～2.0mg/ml，所述t3检测线上pct抗体的包被浓度为1.0～2.0mg/ml；三条检测线的包被量均为0.8～1.2μl/cm。

13、作为优选的技术方案，所述试剂盒还包括稀释液，所述稀释液以 ph 7.4、20mmtris-hcl 缓冲液为基础溶剂，包含如下组分：np-40 0.1~0.3g/l、triton x-100 0.02~0.05ml/l、海藻糖 5~10g/l、聚蔗糖 400 2~5g/l、酪蛋白酸钠 1~2g/l、 peg 6000 1~3g/l、氯化钠 0.3~0.8g/l、甘氨酸 0.5~1g/l、酪蛋白 1~2g/l、鱼明胶 0.5~1g/l、tween-20 0.1~0.3ml/l、鼠 igg fc 片段 0.05~0.1g/l、dnp-bsa 0.001g/l、proclin300 1.0~2.5ml/l。

14、上述技术方案中，所述稀释液中，np-40与triton x-100作为温和的非离子型表面活性剂，二者复配使用可有效裂解白细胞及中性粒细胞，释放胞内mxa蛋白及膜结合态的cd64，同时将可能存在的cd64膜碎片充分乳化分散，暴露其隐蔽的抗原表位，显著提升大尺寸、复杂结构靶标的捕获效率；海藻糖、聚蔗糖400及peg 6000作为渗透保护剂和空间稳定剂，能维持蛋白天然构象，防止抗体及标志物在稀释过程中变性聚集；其次，酪蛋白酸钠、酪蛋白、鱼明胶及甘氨酸构成了多级封闭体系，能够竞争性占据微球表面及nc膜上的潜在非特异性吸附位点，配合磺酸甜菜碱型两性离子基团的抗污特性，进一步降低背景噪声；尤为重要的是，稀释液中特意添加的微量鼠igg fc片段，可预先吸附样本中存在的抗鼠igg异嗜性抗体，阻断其与检测抗体的非特异性结合，消除由此引发的假阳性或背景干扰；而dnp-bsa则作为模拟抗原，能够消耗样本中非特异性的内源性抗dnp抗体，进一步提升检测特异性，该稀释液不仅能实现全血样本的直接裂解与均质化，还能为三种丰度差异巨大的标志物提供稳定的反应环境，确保联合检测的准确度与精密度。

15、第二方面，本发明还提供了上述感染类型快速鉴别试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

16、s1. 对第一荧光微球、第二荧光微球和第三荧光微球进行接枝氨基化聚乙二醇，将接枝聚乙二醇后的微球分散于含磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体的反应体系中，在引发剂作用下进行接枝聚合反应，清洗复溶后，即得第一荧光微球、第二荧光微球和第三荧光微球；

17、s2. 分别将pct标记抗体、mxa标记抗体、cd64标记抗体与步骤s1制得的对应荧光微球上的保留羧基进行共价偶联，经封闭、清洗和复溶后，制得第一荧光微球-pct抗体复合物、第二荧光微球-mxa第一抗体复合物和第三荧光微球-cd64第一抗体复合物；

18、s3.将步骤s2所述的第一荧光微球-pct标记抗体复合物、第二荧光微球-mxa标记抗体复合物和第三荧光微球-cd64标记抗体复合物混合后喷涂于结合垫材料上，干燥制得结合垫；

19、s4.将cd64抗体、mxa抗体、pct抗体及羊抗鼠igg抗体分别划膜于nc膜上，作为t1、t2、t3以及质控线；干燥得到nc膜；

20、s5.取所述样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫依次粘贴在所述pvc底板上，得到所述试纸条，封装后与样本稀释液共同组装为试剂盒。

21、作为优选的技术方案，步骤s3第一荧光微球-pct标记抗体复合物、第二荧光微球-mxa标记抗体复合物和第三荧光微球-cd64标记抗体复合物按体积比1:1:2进行混合。

22、作为优选的技术方案，步骤s1中所述含磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体的反应体系为：20mm磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体、0.5mm过硫酸铵和0.1mm四甲基乙二胺，溶剂为纯水；反应温度为60℃，反应时间为4小时。

23、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

24、本发明针对pct、mxa和cd64三种靶标的分子特性与临床浓度范围差异，通过梯度粒径微球设计、差异化peg间隔臂接枝以及磺酸甜菜碱型两性离子基团改性，系统性解决了现有联合检测技术中三类核心问题：对于不同丰度靶标，通过粒径梯度匹配不同靶标的浓度区间，既保障了低丰度cd64的检测灵敏度，又避免了高丰度mxa的钩状效应，实现了三种标志物检测灵敏度的合理兼顾；对于空间结构复杂的cd64膜蛋白靶标，通过大分子量peg间隔臂将抗体结合位点从微球表面有效延伸，显著降低空间位阻效应，提升了cd64抗原表位的可及性，大幅提高了捕获效率与早期感染检测灵敏度；针对复杂样本基质中的非特异性吸附和微球团聚问题，磺酸甜菜碱型两性离子基团可在微球表面形成稳定亲水层，配合样本稀释液中的多级封闭体系，有效降低背景噪音，抑制微球团聚，显著提升了试剂盒的批间重复性和储存稳定性。

25、本发明的试剂盒可通过一次样本进样，同时获得pct、mxa和cd64三项指标的定量检测结果，无需特殊样本前处理，也不依赖大型专业仪器，为抗生素的合理使用提供直接的实验室依据。