一种狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用

本发明属于试剂盒，具体涉及一种狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus，）感染所致的一种急性人畜共患传染病，其病理特征为严重侵害中枢神经系统，临床上一旦发病，致死率近乎100%。目前，该病尚无有效的治疗手段，因此，对犬群实施大规模免疫接种，以及对暴露人群进行及时的暴露后免疫，仍是防控狂犬病的核心策略。在此背景下，疫苗接种后能否激发机体产生足量的保护性抗体，直接决定了免疫屏障的牢固程度。因此，狂犬病毒抗体检测试剂盒的研发与应用，不仅是评估个体及群体免疫效果的关键技术支撑，更是动态监测抗体消长规律、科学指导加强免疫接种，进而优化整体防控策略的重要保障。

2、当前狂犬病毒抗体检测方法存在一定局限：

3、在抗原制备层面，传统抗原多源自灭活全病毒或纯化糖蛋白，前者需操作活毒，存在生物安全隐患且易引发非特异性反应；后者则面临构象改变及真核可溶性表达产量低、反应原性差等现象，导致检测灵敏度与特异性不足的问题。

4、在检测技术层面，基于胶体金的免疫层析法虽简便快捷，但仅能定性判定，无法实现抗体水平的准确定量问题。

5、elisa试剂盒多采用间接法，且受限于酶标抗体或蛋白a，存在非特异性结合和蛋白构象改变等问题，导致检测效果不佳。

6、综上，现有试剂盒及其制备方法难以兼顾操作便捷性与检测特异性的双重需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用，能够建立适用于全自动化学发光免疫分析仪的液相检测体系，用于定量检测待测犬血清样本中的狂犬病毒抗体，具有高准确度、高特异性、良好的重复性等优势。

2、本发明采取的技术方案具体如下：

3、一种狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒，包括包被抗原磁珠工作液和标记抗体工作液；

4、其中，所述包被抗原磁珠工作液用于与待测血清或对照组样本混合并反应，形成抗原-抗体复合物，所述标记抗体工作液用于与抗原-抗体复合物混合并反应，形成夹心免疫复合物；

5、所述夹心免疫复合物用于放入仪器与化学发光底物液混合并进行发光反应；

6、同时，利用全自动化学发光免疫分析仪获取发光反应过程中的待测样本的相对发光强度值，再根据四参数回归模型拟合的标准曲线，计算得出待测样本中狂犬病毒抗体的效价值，发光信号与待测样本中目标抗体的效价呈正相关。

7、作为一种可选方案，所述包被抗原磁珠工作液包括生物素化标记的狂犬病毒抗原蛋白、链霉亲和素修饰的磁珠、mes稀释液；

8、其中，所述生物素化标记的狂犬病毒抗原蛋白和链霉亲和素修饰的磁珠混合反应，反应后通过稀释的ce210封闭液室温旋转过夜封闭，以封闭磁珠表面未结合的活性位点，减少非特异性吸附；

9、封闭完成后，进行离心操作并移除上清封闭液，用含0.05%吐温20的pbs洗涤磁珠-抗原偶联物5～10次，再通过mes保存液重悬磁珠，得到所述的包被抗原磁珠保存液；

10、将包被抗原磁珠保存液通过mes稀释液进行梯度稀释，得到所述的包被抗原磁珠工作液。

11、作为一种可选方案，所述标记抗体工作液包括吖啶酯、标记抗体和mes稀释液；

12、其中，所述吖啶酯加入二甲基亚砜混合配置为储存液，所述储存液加入pbs稀释液进行稀释，在得到吖啶酯工作液，在所述标记抗体中加入吖啶酯工作液并混匀，混匀后加入mes稀释液稀释至工作浓度，得到标记抗体工作液。

13、一种狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒的制备方法，用于制备如所述的狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒，包括以下步骤：

14、准备初始材料并配置试剂和仪器；

15、进行重组g蛋白胞外域表达pfastbac1-gg质粒的设计，通过pfastbac1-gg质粒的转化、提取、筛选，以及杆粒提取，得到重组杆粒dna溶液；

16、通过sf9细胞转染重组杆粒dna，得到重组杆状病毒原液，对重组杆状病毒进行扩增，扩增后进行纯化，得到狂犬病毒抗原蛋白；

17、采用生物素-链霉亲和素偶联体系，将生物素化标记的狂犬病毒抗原蛋白定向固定于链霉亲和素修饰的磁珠表面，得到上述包被抗原磁珠工作液；

18、将吖啶酯共价偶联至标记抗体上，得到上述标记抗体工作液；

19、将包被抗原磁珠工作液与待测血清或标准品样本混合并反应，形成抗原-抗体复合物，并将标记抗体工作液用于与抗原-抗体复合物混合并反应，形成夹心免疫复合物；

20、将夹心免疫复合物用于放入仪器与化学发光底物液混合并进行发光反应；

21、同时，获取发光反应过程中的相对发光强度值，将相对发光强度值代入四参数回归模型拟合的标准曲线，标准曲线用于根据待测品的相对发光强度值计算得待测品中出抗体的效价；

22、对照组是效价为0.5iu/ml的狂犬病毒中和抗体，测定对照组的相对发光强度值，用于验证标准曲线。

23、作为一种可选方案，所述将狂犬病毒抗原蛋白定向固定于链霉亲和素修饰的磁珠表面具体包括以下步骤：

24、取定量狂犬病毒抗原蛋白，补加pbs并进行超滤，超滤完毕进行生物素化标记，标记后进行超滤，得到抗原溶液；

25、取定量链霉亲和素修饰的磁珠，补加pbs重悬后离心弃上清液，得到磁珠沉淀；

26、将磁珠沉淀与抗原溶液混合，并补加pbs，涡旋振荡充分重悬，反应后得到磁珠重悬溶液；

27、向磁珠重悬溶液加入ce210封闭液，室温旋转过夜封闭，以封闭磁珠表面未结合的活性位点，减少非特异性吸附，封闭完成后，进行离心操作并移除上清封闭液，用含吐温20的pbs进行洗涤，再用mes保存液重悬磁珠，得到包被抗原磁珠保存液；

28、向包被抗原磁珠保存液中加入mes稀释液进行梯度稀释，得到包被抗原磁珠工作液。

29、作为一种可选方案，所述取定量狂犬病毒抗原蛋白，补加pbs并进行超滤具体包括步骤补加pbs至500μl，采用50kda截留分子量的超滤管，将超滤管放置于离心机以8000rpm的转速离心5min，重复超滤三次，每次补加pbs至500μl，最终浓缩至100μl。

30、作为一种可选方案，所述将吖啶酯共价偶联至标记抗体上，得到标记抗体工作液具体包括以下步骤：

31、取定量兔抗犬igg抗体，补加pbs至总体积500μl，装入超滤离心管，将离心管放置于离心机以8000rpm的转速离心5min，重复超滤三次，每次离心后补加pbs至500μl，最终浓缩至体系体积为100μl；

32、超滤完成后再次测定蛋白浓度，确保回收率及浓度一致性；

33、随后，将处理后的兔抗犬igg抗体溶液与吖啶酯试剂进行标记反应，吖啶酯母液以二甲基亚砜配制为储存液，向抗体溶液中加入10μl稀释后的吖啶酯工作液，立即涡旋振荡充分混匀，置于室温下避光反应2h，反应期间每10min涡旋混匀一次，以保证标记反应的均匀性和偶联效率；

34、反应结束后，向反应体系中补加pbs，使用相同截留分子量的超滤管离心处理，重复此超滤-补液操作至少5次，直至游离吖啶酯被充分清除；

35、将纯化后的吖啶酯标记抗体用mes缓冲液保存，得到标记抗体保存液，将标记抗体保存液用mes稀释液稀释，得到标记抗体工作液。

36、作为一种可选方案，所述纯化后的吖啶酯标记抗体用含有0.5%牛血清白蛋白的mes缓冲液保存，调整终浓度为100μg/ml，于4℃避光保存备用，即为标记抗体保存液，将标记抗体保存液用相同mes稀释液稀释至工作浓度1μg/ml，得到标记抗体工作液。

37、作为一种可选方案，所述将夹心免疫复合物用于放入仪器与化学发光底物液混合并进行发光反应具体包括以下步骤：

38、取包被抗原磁珠工作液加入反应杯，并加入待测血清或标准品样本，将反应杯放置于全自动化学发光免疫分析仪，通过振荡混匀程序使磁珠与样本充分接触，孵育反应10min，形成抗原-抗体复合物；

39、向反应杯中加入稀释后的标记抗体工作液，再次振荡混匀，孵育反应10min，形成磁珠-抗原-目标抗体-标记抗体夹心免疫复合物；

40、反应结束后，全自动化学发光免疫分析仪内置的磁分离清洗系统和清洗液进行非结合物去除，重复清洗3次，去除未结合的标记抗体、样本基质中的干扰物质及游离吖啶酯背景信号，降低非特异性本底，提高信噪比；

41、清洗完成后，按照全自动化学发光免疫分析仪自动向反应杯中加入化学发光底物液，启动发光反应，由全自动化学发光免疫分析仪光电倍增管检测相对发光强度并记录。

42、一种狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒的应用，所述狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒根据所述的制备方法而成，所述狂犬病毒抗体化学发光检测试剂盒用于检测狂犬病毒抗体。

43、本发明取得的技术效果为：

44、本发明，建立了一套适用于全自动化学发光免疫分析仪的液相检测体系，用于定量检测待测犬血清样本中的狂犬病毒抗体，该方法具有高准确度（相对偏差在±10%范围内）、良好的重复性（批内、批间cv＜8%），及与犬细小、犬瘟热、犬副流感抗体阳性血清无交叉反应，展现其良好的特异性。

45、本发明，提供一种狂犬病毒检测试剂盒，检测不涉及活毒、操作简便、30min出结果、成本低，可实现高通量快速检测等优势，在狂犬病免疫监测中具有极大的应用潜力。

46、本发明，制备一种狂犬病毒检测试剂盒，该试剂盒利用杆状病毒表达系统构建了pfastbac1-gg重组质粒。通过对糖蛋白的基因改造，实现了狂犬病毒糖蛋白在昆虫细胞中可溶性高表达，保证了糖蛋白与待测犬血清样本中的狂犬病毒抗体具有较好的反应原性，为后续制备试剂盒提供了最佳抗原。