水体粪源污染的定量溯源方法与流程

本发明属于环境微生物检测和环境监测，涉及水体粪源污染的定量溯源方法，具体涉及一种基于流式细胞多参数指纹的水体粪源污染定量溯源方法。

背景技术：

1、水体粪源微生物污染是影响水环境安全和公共健康的重要因素。来自人类、畜禽养殖以及野生动物等不同来源的粪便污染物进入河流、湖泊及地下水体后，会携带大量微生物及潜在致病菌，对饮用水安全和生态环境造成潜在风险。因此，准确识别水体中粪源污染的来源，并评估不同污染来源对水体污染的贡献程度，对于水环境污染控制和公共卫生风险评估具有重要意义。

2、目前，水体粪源污染溯源（microbial source tracking，mst）主要依赖于分子生物学方法，例如特异性标记基因的定量pcr检测或高通量测序分析等技术手段，通过检测不同宿主来源微生物的特征基因或群落结构特征来推断污染来源。然而，该类方法通常需要复杂的样品处理和核酸提取过程，检测周期较长，检测成本较高，且在低生物量环境样品中稳定性和可重复性受到一定限制。此外，现有多数mst方法主要用于判别污染来源或估算来源贡献比例，对于不同污染来源微生物细胞数量的定量估算能力仍然有限。

3、流式细胞术是一种能够在单细胞水平快速检测微生物群体特征的技术手段，通过检测微生物细胞的散射信号和荧光信号，可以获得细胞大小、结构及荧光标记等多参数信息，并可进一步构建微生物群落的流式细胞指纹特征。同时，流式细胞术还能够实现环境样品中微生物细胞数量的快速检测，为污染来源贡献量的定量估算提供了可能。然而，目前利用流式细胞多参数信息进行水体粪源污染溯源分析的研究仍较为有限，尤其缺乏稳定的流式细胞指纹构建参数体系以及结合细胞数量实现污染来源定量分析的方法。

4、因此，开发一种基于流式细胞多参数指纹的水体粪源污染定量溯源方法，在实现污染来源快速判别的同时，对不同污染来源的细胞贡献量进行定量估算，对于提高水体污染溯源分析效率和准确性具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种水体粪源污染的定量溯源方法，以实现水体粪源污染来源的快速识别，并对不同污染来源的微生物细胞贡献量进行定量估算。

2、为了实现本发明的目的，本发明提供一种基于流式细胞多参数指纹的水体粪源污染定量溯源方法，其步骤包括：

3、采集环境水体样品和潜在污染来源样品，分别对所述样品进行预处理以获得各自的悬浮微生物细胞群体；所述环境水体样品为待进行污染来源解析的受纳水体样品，所述潜在污染来源样品为可能向所述环境水体输入微生物污染的来源样品，包括但不限于生活污水、污水处理厂出水、雨污混合排水、家养动物污染样品（包括畜禽粪便、宠物粪便等）、野生动物污染样品（包括鸟类、哺乳动物等野生动物粪便）、农业径流、河流支流及其他潜在污染来源样品。

4、分别向所述环境水体样品和潜在污染来源样品中加入核酸荧光染料syto9和细胞膜完整性指示染料pi，对微生物细胞进行双色荧光标记，并采用统一的活细胞门控策略筛选各样品中syto9阳性且pi阴性的目标细胞群体；

5、分别利用流式细胞仪对所述环境水体样品和潜在污染来源样品的目标细胞群体进行多通道散射信号与荧光信号检测，获得各样品单细胞层级的多参数信号数据；

6、分别对所述环境水体样品和潜在污染来源样品获得的多参数信号数据进行非线性变换和归一化处理，在限定分区分辨率范围内构建流式细胞指纹网格，并在受限带宽范围内进行核密度估计，获得各样品的流式细胞指纹矩阵；

7、利用phenoflow程序包计算流式细胞指纹特征，并将环境水体样品的流式细胞指纹矩阵作为sourcetracker模型的待解析（sink）数据，将潜在污染来源样品的流式细胞指纹矩阵作为参考来源（source）数据进行比对分析，通过比较待解析样品与参考来源样品流式细胞表型指纹特征的组成差异及相似性，估算待解析样品中不同表型特征来源于各潜在污染来源的概率，并据此计算不同污染来源对环境水体样品的贡献比例；

8、结合流式细胞检测获得的样品微生物细胞总量，根据下述公式估算不同污染来源的细胞贡献量：。

9、其中，ci表示来源i的细胞贡献量，pi表示来源i在环境水体样品中的贡献比例，n表示环境水体样品中的微生物细胞总量；

10、从而实现水体粪源污染来源的定量溯源。

11、在具体实施方式中，所述样品预处理包括：对环境水体样品通过滤膜进行过滤以去除较大颗粒杂质，所述滤膜孔径为20-50μm；对污染来源样品进行离心处理以收集微生物细胞沉淀，离心条件为12000-15000rpm、3-5min、2-8℃；将离心后的沉淀重悬于pbs缓冲液中，以获得悬浮微生物细胞群体。

12、在一个具体实施方式中，所述核酸荧光染料为syto9，所述细胞膜完整性指示染料为碘化丙啶（pi）；分别向环境水体样品和潜在污染来源样品中加入syto9和pi染料，终浓度为0.5-2μm，并在避光条件下孵育15-30min，以实现对各样品中微生物细胞的双色荧光标记。

13、在一个优选实施方式中，在进行流式细胞检测前对鞘液及缓冲液进行背景检测，并采用统一的活细胞门控策略分别筛选环境水体样品和潜在污染来源样品中syto9阳性且pi阴性的目标细胞群体；采集不少于10000个单细胞事件，优选不少于15000个单细胞事件，以保证流式细胞指纹分析的稳定性。

14、在一个具体实施方式中，所述流式细胞检测通道包括前向散射信号（fsc）、侧向散射信号（ssc）以及至少两个荧光检测通道，用于获取环境水体样品和潜在污染来源样品中微生物细胞的多参数信号特征。

15、在一个具体实施方式中，分别对环境水体样品和潜在污染来源样品获得的多参数信号数据在进行指纹构建前处理，采用双曲正弦函数进行非线性变换，并对变换后的信号进行归一化处理，以降低信号动态范围并增强低强度信号的分辨能力。

16、在一个优选实施方式中，所述流式细胞指纹网格分辨率为64×64至256×256，优选为128×128；所述核密度估计带宽为0.001-0.010，优选为0.005，以获得稳定的流式细胞指纹特征矩阵。

17、在一个具体实施方式中，通过流式细胞检测获得环境水体样品中的微生物细胞总量，并结合不同潜在污染来源对环境水体样品的贡献比例，计算不同潜在污染来源的微生物细胞贡献量。该方法在实现污染来源判别的同时，可进一步获得不同潜在污染来源对环境水体样品的细胞贡献量，从而实现水体粪源污染来源的定量分析。

18、本发明基于流式细胞多参数指纹构建实现水体粪源污染的定量溯源，相较于传统依赖分子生物学检测的粪源污染溯源方法，本发明能够在实现污染来源判别的同时，对不同污染来源的微生物细胞贡献量进行估算，从而为水体粪源污染来源分析提供更加直观和全面的信息支持。因为传统的水体粪源污染溯源技术主要依赖于特异性基因标记的定量pcr检测或高通量测序分析，通过检测不同宿主来源微生物的遗传信息来推断污染来源，该类方法通常需要复杂的样品处理和核酸提取过程，检测周期较长，检测成本较高，并且通常只能获得污染来源的相对贡献比例，难以进一步估算不同污染来源的微生物细胞数量。而本发明通过流式细胞技术获取环境样品中微生物细胞的多参数散射信号和荧光信号，并构建微生物群落的流式细胞指纹特征，在此基础上结合污染来源分析方法对不同污染来源的贡献比例进行计算，同时利用流式细胞检测获得的微生物细胞总量对不同污染来源的细胞贡献量进行估算，从而实现水体粪源污染来源的定量溯源分析。

19、因此，本发明不仅能够实现环境水体中粪源污染来源的快速判别，而且能够对不同污染来源的微生物细胞数量进行估算，具有分析速度快、检测成本低、无需复杂核酸提取步骤、适用于低生物量环境样品等优点，可为环境水体污染来源监测和风险评估提供一种新的技术手段。