一种酶标记抗体信号探针的制备方法以及在检测中药材中玉米赤霉烯酮的应用

本发明涉及中药材检测的，具体涉及一种酶标记抗体信号探针的制备方法以及在检测中药材中玉米赤霉烯酮中的应用。

背景技术：

1、中药材中玉米赤霉烯酮（zen）被称为中药材预警标志物，zen属于非甾体类真菌毒素，是全球范围内污染最为广泛的真菌毒素之一，具体由镰刀菌侵染中药材后产生，是该类致病菌侵染过程中具有代表性的次生代谢产物。该物质的微量检出可作为中药材质量安全的预警“信号”，zen具有明确的致癌性，可对人体及动物的生殖系统、细胞功能与免疫系统造成多方面损害；一旦通过食用被污染的中药材摄入，将对生命健康构成严重威胁。

2、目前，检测zen的方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、薄层色谱法、免疫分析法等。这些方法虽然可以定量分析和检测zen，但操作复杂，对检测环境要求较高。这些复杂性阻碍了中药材的即时分析，并对其广泛应用构成挑战。基于高特异性抗体-抗原识别的免疫生物传感器具有特殊的特异性、低成本和快速分析的优点，已被广泛用于各种疾病相关生物标志物的灵敏检测。

3、因此，亟需一种新型的信号标签，以开发将生物识别单元作为第二蛋白质成分加到酶-无机的杂交纳米花中，实现一步法酶级联催化反应以及对zen的精准检测，对中药材质量安全的早期预警与风险防控具有关键意义，同时对保障食品安全、维护人体健康也具备重要的现实价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提出一种酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs的智能手机级联免疫传感平台在中药材中zen检测方法。

2、为实现其目的，本发明一方面提供了一种酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnf的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

3、1）将ni(no3)2·6h2o、co(no3)2·9h2o分散在2-丙醇中，得到镍-钴盐溶液并持续搅拌；在所述镍-钴盐溶液中加入纯甘油，溶液变为淡粉色后，在160-200℃温度下加热14-18小时获得ni-co nss；

4、2）将所述ni-co nss搅拌、超声后在160℃下加热7小时，并在氩气氛围中煅烧得到双金属氧化物nio/coo hnfs；

5、3）将h2ptcl6 6h2o溶解于聚乙烯吡咯烷酮-乙二醇溶液后进行加热至180°c，冷却至室温后经过离心洗涤收集铂纳米粒子；

6、4）将步骤3）中得到的铂纳米粒子分散在去离子水中，得到铂纳米粒子溶液；在磁搅拌下，将制备好的铂纳米粒子溶液滴入nio/coo hnfs溶液中持续搅拌获得pt@nio/coohnfs；

7、所述铂纳米粒子与nio/coo hnfs的固液比为（1-4）g：10ml；

8、5）将步骤4）中得到的pt@nio/coo hnfs分散在含有氨基修饰的聚乙二醇的水溶液中继续搅拌得到nh2-peg-pt-nio/coo，然后将其注入到gox溶液中；反应后离心获得gox-pt@nio/coo hnfs；

9、6）将所述gox-pt@nio/coohnfs分散在pbs中，然后加入igg；随后加入的牛血清白蛋白溶液并搅拌；最后，离心收集洗涤、冷冻干燥，获得igg-gox-pt@nio/coo hnfs。

10、进一步，所述步骤1）中ni(no3)2·6h2o与co(no3)2·9h2o的摩尔比为2：（3-6）；ni(no3)2·6h2o与2-丙醇的固液比为（0.5-1.0）g：2ml。

11、进一步，所述步骤5）中nh2-peg-pt-nio/coo hnfs与gox的液固比为（5-10）ml：10mg。

12、进一步，所述步骤6）中gox-pt@nio/coo hnfs与pbs的固液比为（1-5）mg：5ml。

13、进一步，所述步骤6）中gox-pt@nio/coo与igg的质量比为（0.5-2）：2。

14、本申请另一方面还提供了一种根据上述的制备方法所制备得到的酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs。

15、本申请另一方面还提供了一种检测中药材中玉米赤霉烯酮含量的方法，所述方法包括利用如权利要求6所述的酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs构建中药材中的玉米赤霉烯酮的比色传感工作曲线，测定玉米赤霉烯酮的含量。

16、进一步，所述比色传感工作曲线的构建包括以下步骤：

17、①将bsa-zen偶联抗原溶液加入到96孔微孔板中；

18、②用pbst缓冲液清洗①中微孔板，并用脱脂奶粉封闭缓冲液封闭非特异性活性位点；所述pbst缓冲液为0.01m磷酸盐缓冲液，含0.05%吐温20，ph7.4；

19、③在步骤②中按照规定比例加入不同浓度的zen与抗zen单克隆抗体（mcab）混合；

20、④在室温下孵育后，向③中每个孔加入igg-gox-pt@nio/coo hnfs探针；

21、⑤在④中加入tmb和h2o2在室温下孵育10min后，利用紫外分光光度计记录反应溶液在652nm处的吸光度；

22、⑥制备得到igg-gox-pt@nio/coo hnfs探针材料检测中药材中的zen的比色传感工作曲线。

23、进一步，步骤①加入的bsa-zen为1mg ml-1；步骤③加入mcab为0.75μg ml-1；步骤⑤加入的tmb为50μl，加入的h2o2为50μl 250mmol l-1。

24、本申请另一方面还提供了一种根据上述的酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs在检测中药材中玉米赤霉烯酮含量中的应用。

25、本发明的有益效果：

26、1、本发明构建了一种酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs的智能设备级联免疫传感平台，实现了中药材中zen的精确定量检测目的；

27、2、本发明利用抗体-酶-无机复合纳米花独特的分级结构及级联催化作用放大检测信号，结合智能手机实现信号便携式读取，该方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围、较快的检测速度以及操作简单等优点，可用于中药材中zen的现场即时检测；

28、3、构建中药材中zen的比色检测系统具有重要意义，为中药材质量安全监测相关领域的研究及探索进一步提供了参考依据。

1.一种酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnf的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中ni(no3)2·6h2o与co(no3)2·9h2o的摩尔比为2：（3-6）；ni(no3)2·6h2o与2-丙醇的固液比为（0.5-1.0）g：2ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中nh2-peg-pt-nio/coohnfs与gox的液固比为（5-10）ml：10mg。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6）中gox-pt@nio/coo hnfs与pbs的固液比为（1-5）mg：5ml。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6）中gox-pt@nio/coo与igg的质量比为（0.5-2）：2。

6.一种根据权利要求1-5任一项所述的制备方法所制备得到的酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs。

7.一种检测中药材中玉米赤霉烯酮含量的方法，其特征在于，所述方法包括利用如权利要求6所述的酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs构建中药材中的玉米赤霉烯酮的比色传感工作曲线，测定玉米赤霉烯酮的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述比色传感工作曲线的构建包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤①加入的bsa-zen为1mg ml-1；步骤③加入mcab为0.75μg ml-1；步骤⑤加入的tmb为50μl，加入的h2o2为50μl 250mmol l-1。

10.一种根据权利要求8所述的酶标记抗体信号探针igg-gox-pt@nio/coo hnfs在检测中药材中玉米赤霉烯酮含量中的应用。