一种25-羟基维生素D解离液、制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学检测，特别是涉及一种25-羟基维生素d解离液、制备方法和应用。

背景技术：

1、维生素d的发现源自1920~1930年对佝偻病的研究，它是一种脂溶性开环固醇类激素前体，其活性产物属于重要的钙磷调节激素之一。维生素d包括动物来源的维生素d3（胆骨化醇）和植物来源的维生素d2（麦角固醇），人体约80%的维生素d是皮肤在紫外线照射下以胆固醇为原料合成的维生素d3，约20%是经食物摄入的维生素d2或d3。维生素d经25羟化酶催化合成25-羟维生素d（25-oh-vd），是体内维生素d的主要贮存形式，反映维生素d的营养状况。25-oh-vd经过1α羟化酶作用，成为1,25-双羟维生素d［1，25（oh）2d］，后者是维生素d的主要活性代谢产物，与组织中广泛存在的维生素d受体结合，发挥重要的骨骼及骨骼外作用，又称活性维生素d或d激素。25-oh-vd是循环中浓度最高的维生素d代谢物，且血半衰期较长，是反映维生素d营养状况的良好指标，建议在可能存在维生素d缺乏或代谢异常的高危人群中评估血清25-oh-vd浓度。

2、25-oh-vd为疏水性小分子，在血清或血浆样本中，超过99%的25-oh-vd以与维生素d结合蛋白非共价结合的形式存在，仅不到1%以游离形式存在，因此在25-oh-vd检测中，将25-oh-vd从维生素d结合蛋白中解离下来显得尤为关键。目前25-oh-vd的检测方法包括液相色谱-串联质谱法，化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附法，化学发光免疫分析法是临床上应用最广泛的方法。

3、现有技术中已公开了多种25-羟基维生素d解离液的配方。例如，中国专利cn119492587a 公开了一种解离剂，包含蛋白分解剂（胍盐和强酸）、表面活性剂（tritonx-100、s9）、洗涤剂（十二烷基硫酸钠）、金属络合剂（edta-2na）。中国专利cn120121593a公开了一种解离剂，包括氟代烷基表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲液、生理盐水。中国专利cn119510784b公开了一种解离液，包含10~100mm且ph7.2~7.4的缓冲液、0.1%~5%长链烷烃羧酸、0.1%~1%有机溶剂。

4、上述方法有如下缺点：①部分配方使用全氟辛酸等含氟表面活性剂作为核心解离成分，存在毒性风险和环境污染问题；②强酸强碱类解离液易对后续免疫反应中的抗体活性产生不利影响，破坏检测体系的稳定性。③单一的变性剂，解离效果不好。④未有保护剂、防腐剂，稳定性存在问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种25-羟基维生素d解离液、制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的解离液解离效果差、强酸强碱影响免疫反应、全氟辛酸等含氟表面活性剂存在毒性风险和环境污染、稳定性差问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种25-羟基维生素d解离液，所述25-羟基维生素d解离液由缓冲液、植物源黄酮类保护剂、表面活性剂、还原剂、还原剂增强剂、络合剂和防腐剂组成；所述植物源黄酮类保护剂选自槲皮素、柚皮素、黄芩素和山柰酚中的至少一种。本发明所述植物源黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性和生物安全性，能够有效淬灭自由基，防止25-羟基维生素d在解离过程中被氧化破坏，同时具有维持长期保存过程中解离液稳定性的作用，解决了现有技术中解离液保存稳定性的问题。

4、优选的，所述25-羟基维生素d解离液由缓冲液和如下浓度的组分组成：0.5%~1.5%（w/v）的植物源黄酮类保护剂、1%~5%（v/v）的表面活性剂，0.2%~1%（w/v）的还原剂、0.2%~1%（w/v）还原剂增强剂、1mm~5mm的络合剂和0.1%~0.3%（v/v）防腐剂；所述缓冲液为溶剂。

5、优选的，所述络合剂选自edta-2na。

6、优选的，所述缓冲液选自hepes、tris、mopso中的至少一种；所述缓冲液的浓度为20~100mm且ph 6.0~8.0。所述缓冲液用于为解离反应提供适宜的ph环境，维持解离过程中蛋白质结构的可控变性，有利于后续免疫反应中抗原与抗体的识别与结合，解决了现有技术中解离液对后续免疫反应产生不利影响的问题。

7、优选的，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯-20（tween-20）、曲拉通x-100（tritonx-100）和聚氧乙烯月桂醚（brij-35）中的至少一种；所述还原剂选自β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦（tcep）中的至少一种；

8、优选的，所述还原剂增强剂为盐酸胍；

9、所述防腐剂选自proclin300和/或5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷（bnd）。

10、所述表面活性剂通过破坏维生素d结合蛋白的疏水相互作用区域，促使目标分析物从结合位点释放。

11、所述还原剂通过断裂维生素d结合蛋白分子间的二硫键，进一步瓦解其空间构象，实现蛋白分子的充分展开与解离，与表面活性剂产生协同增效作用。

12、所述还原剂增强剂能增强还原剂的还原效果。

13、本发明提供一种25-羟基维生素d解离液的制备方法，包括：

14、将所述植物源黄酮类保护剂、表面活性剂、还原剂、还原剂增强剂、络合剂和防腐剂与缓冲液混匀，调节ph至6.0-8.0。本发明的解离液以缓冲液为溶剂。

15、本发明提供一种25-羟基维生素d解离液在解离或者检测25-羟基维生素d含量中的应用。

16、本发明提供一种25-羟基维生素d解离液在制备解离或者检测25-羟基维生素d含量的试剂中的应用。

17、本发明提供一种解离或者检测25-羟基维生素d的试剂盒，包含25-羟基维生素d解离液。

18、本发明公开了以下技术效果：

19、本发明的目的在于提供一种25-羟基维生素d解离液，旨在解决现有解离液存在的稳定性差、有毒的技术问题，即本发明提供一种无氟、低毒、中性ph、稳定性好且解离效率高的25-羟基维生素d解离液。实验结果表明本发明的解离液的解离效果佳、稳定性佳、呈中性ph、无氟、低毒。

1.一种25-羟基维生素d解离液，其特征在于，所述25-羟基维生素d解离液由缓冲液、植物源黄酮类保护剂、表面活性剂、还原剂、还原剂增强剂、络合剂和防腐剂组成；所述植物源黄酮类保护剂选自槲皮素、柚皮素、黄芩素和山柰酚中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的25-羟基维生素d解离液，其特征在于，所述25-羟基维生素d解离液由缓冲液和如下浓度的组分组成：0.5%~1.5%w/v的植物源黄酮类保护剂，1%~5%v/v的表面活性剂、0.2%~1%w/v的还原剂、0.2%~1%w/v还原剂增强剂、1mm~5mm的络合剂和0.1%~0.3%v/v防腐剂。

3.根据权利要求1或2所述的25-羟基维生素d解离液，其特征在于，所述络合剂选自edta-2na。

4.根据权利要求1或2所述的25-羟基维生素d解离液，其特征在于，所述缓冲液选自hepes、tris、mopso中的至少一种；所述缓冲液的浓度为20~100mm且ph值为6.0~8.0。

5.根据权利要求1所述的25-羟基维生素d解离液，其特征在于，所述表面活性剂选自tween-20、tritonx-100和聚氧乙烯月桂醚中的至少一种；所述还原剂选自β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦中的至少一种；

6.权利要求1-5任一项所述的25-羟基维生素d解离液的制备方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求1-5任一项所述的25-羟基维生素d解离液或权利要求6所述制备方法制备得到的25-羟基维生素d解离液在解离或者检测25-羟基维生素d含量中的应用。

8.根据权利要求1-5任一项所述的25-羟基维生素d解离液或权利要求6所述制备方法制备得到的25-羟基维生素d解离液在制备解离或者检测25-羟基维生素d含量的试剂中的应用。

9.一种解离或者检测25-羟基维生素d的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-5任一项所述的25-羟基维生素d解离液或权利要求6所述制备方法制备得到的25-羟基维生素d解离液。