一种贝前列素钠缓释片中L-谷氨酸含量测定的前处理方法

本发明涉及药物分析检测，尤其涉及一种贝前列素钠缓释片中l-谷氨酸含量测定的前处理方法。

背景技术：

1、贝前列素钠缓释片通常采用亲水凝胶骨架实现药物缓释，常用骨架材料包括聚氧化乙烯（peo）、羟丙甲纤维素（hpmc）、羟丙基纤维素（hpc）等。处方中还可包含聚乙二醇、l-谷氨酸和硬脂酸镁等辅料，其中l-谷氨酸可作为功能性稳定辅料，对其游离态含量进行准确测定，对于评价制剂处方符合性、批次一致性及储存稳定性具有重要意义。游离l-谷氨酸通常可采用氨基酸分析仪进行定量检测。

2、目前市售贝前列素钠缓释制剂中，日本原研制剂采用高分子量聚氧化乙烯（peo）作为缓释骨架，并配伍聚乙二醇6000、硬脂酸镁及l-谷氨酸等辅料。相较于hpmc等常规纤维素类骨架，高分子量peo分子链较长、缠绕程度高，遇水后易形成高黏度凝胶，对l-谷氨酸产生包裹和吸附，从而增加样品提取及过滤处理难度。因此，能够适用于高分子量peo骨架体系的l-谷氨酸前处理方法，对于hpmc等其他亲水高分子骨架缓释制剂亦具有较好的适用潜力。

3、现有游离氨基酸检测的常规前处理方法多采用酸浸提，并通过磺基水杨酸沉淀蛋白、edta络合金属离子等方式除杂。但贝前列素钠缓释片中的主要干扰物并非蛋白质，而是peo、hpmc、hpc及peg等亲水高分子形成的凝胶或胶体。磺基水杨酸难以有效去除此类高分子杂质，且酸性环境还可能加重部分体系的胶凝和黏度；常规单级过滤也难以充分去除细小胶体颗粒。因此，直接采用传统前处理工艺容易出现l-谷氨酸提取不完全、滤膜堵塞、回收率及重复性下降等问题，残留胶体进入氨基酸分析仪后还可能造成基线干扰、柱压异常及色谱系统污染。

4、此外，结合态氨基酸检测常用的高温强酸水解方法亦不适用于游离l-谷氨酸的测定。高温强酸条件可能促使l-谷氨酸发生脱水环化等反应，影响目标物准确测定，同时还可能造成亲水高分子骨架降解并产生新的基质干扰。纯水超声或简单酸浸提虽然能够促进样品分散，但难以充分解除高分子骨架对l-谷氨酸的包裹和吸附。

5、因此，现有蛋白沉淀除杂、普通酸浸提、高温强酸水解以及简单超声过滤等前处理方式均难以充分适应亲水凝胶骨架缓释制剂的基质特点，有必要建立一种能够促进游离l-谷氨酸充分提取、有效去除高分子凝胶及胶体杂质，并与氨基酸分析仪检测相适配的样品前处理方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种贝前列素钠缓释片中l-谷氨酸含量测定的前处理方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种贝前列素钠缓释片中l-谷氨酸含量测定的样品前处理方法，所述方法用于对含亲水凝胶型高分子骨架的贝前列素钠缓释片中游离l-谷氨酸进行前处理，所述方法包括如下步骤：

4、（1）样品预处理：将贝前列素钠缓释片粉碎、过筛，称取样品粉末置于密封容器中；

5、（2）醇水预分散：向所述样品粉末中加入乙醇-水混合溶剂，涡旋分散后静置，得到溶液a；

6、（3）弱碱低温絮凝除胶：向溶液a中加入弱碱性缓冲液，将体系ph调节至7.0～7.5，于4～10 ℃条件下静置，随后离心并收集上清液；

7、（4）低浓度盐酸恒温浸提：向所述上清液中加入0.4～0.6 mol/l盐酸，于40～45℃条件下浸提30～40 min，得到浸提液；

8、（5）分级过滤：将所述浸提液冷却至室温并调节ph至2.2～2.8，依次经0.45 μm水系微孔滤膜粗滤、超滤膜过滤以及0.22 μm水系微孔滤膜终端过滤，获得用于氨基酸分析仪测定的待测样品。

9、优选地，步骤（2）中，所述乙醇-水混合溶剂中，所述乙醇与水的体积比为3:7～5:5，所述乙醇-水混合溶剂的加入量为每0.10 g样品粉末加入10～20 ml；

10、所述涡旋的时间为3～5 min，所述静置为室温条件下静置10～15 min。

11、优选地，步骤（3）中，所述弱碱性缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所述静置的时间为15～30 min，所述离心的条件为8000～10000 r/min离心8～10 min。

12、优选地，步骤（2）中，所述乙醇与水的体积比为4:6，每0.10 g所述样品粉末加入15ml所述乙醇-水混合溶剂；

13、所述涡旋的时间为5 min，所述静置为室温条件下静置10 min；

14、所述步骤（3）中，所述体系ph为7.2；所述静置为4 ℃条件下静置20 min，所述离心的条件为8000r/min离心10 min。

15、优选地，步骤（4）中，所述盐酸的浓度为0.5 mol/l，所述浸提的温度为45 ℃，所述浸提的时间为35 min，所述浸提的过程中每隔5 min进行一次轻柔涡旋。

16、优选地，步骤（5）中，所述超滤膜的截留分子量为10 kda。

17、优选地，所述亲水凝胶型高分子骨架选自聚氧化乙烯、羟丙甲纤维素和羟丙基纤维素中的一种或两种以上。

18、优选地，所述贝前列素钠缓释片还包含聚乙二醇类赋形剂、l-谷氨酸稳定剂及硬脂酸镁润滑剂。

19、第二方面，本发明提供了一种贝前列素钠缓释片中游离l-谷氨酸检测用待测样品，所述待测样品为经上述样品前处理方法得到的液体样品，所述液体样品的ph为2.2～2.8，浊度不高于0.20 ntu，动力黏度不高于1.0 mpa·s。

20、第三方面，本发明提供了一种贝前列素钠缓释片中游离l-谷氨酸含量的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：

21、（1）采用上述的样品前处理方法制备待测液；

22、（2）采用氨基酸分析仪对所述待测液中的l-谷氨酸进行定量检测；

23、（3）根据l-谷氨酸对照品建立的外标定量关系计算贝前列素钠缓释片中游离l-谷氨酸的含量。

24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

25、（1）本发明所提供的方法能够有效解决亲水凝胶骨架缓释制剂的胶凝和堵膜问题。本发明针对peo、hpmc、hpc及peg等亲水高分子在水相或酸性环境中易发生水合缠结、形成高黏度凝胶的特点，采用醇水预分散解缠与弱碱低温絮凝相结合的方式，在目标物浸提前对高分子基质进行状态调控和宏观除胶，可显著降低体系浊度和黏度，减少滤膜堵塞及进样系统污染。

26、（2）本发明所提供的方法能够提高游离l-谷氨酸的提取完整性和检测准确度。本发明在去除主要高分子凝胶后，采用低浓度盐酸温和恒温浸提，使缓释骨架微孔中被包裹、吸附的游离l-谷氨酸充分解吸进入液相，同时避免高温强酸条件导致l-谷氨酸发生结构转化。实施例中l-谷氨酸平均回收率达到99.43%，rsd仅为0.63%，表现出良好的准确度和重复性。

27、（3）本发明所提供的方法能够有效去除不同尺度的基质杂质，提升仪器适配性。本发明采用“0.45 μm粗滤→10 kda超滤→0.22 μm终端精滤”的分级过滤方式，分别去除微米级颗粒、高分子细小胶体及终端微粒，可降低隐性胶体对氨基酸分析仪离子交换分离的影响，使所得待测液澄清透明、无明显乳光，检测过程中基线稳定、柱压正常。

28、（4）本发明所提供的方法在各工序之间具有明显的协同作用，并非简单叠加。醇水预分散为后续低温絮凝创造条件，低温絮凝降低宏观高分子负荷，低浓度盐酸恒温浸提进一步保证目标物充分释放，分级过滤则完成微观净化和终端进样控制。任一核心步骤缺失，均会导致回收率、精密度、澄清度或仪器适配性下降；即使采用3 kda强化超滤，对比例7的平均回收率仍仅为86.08%，说明单纯增强后端过滤不能替代本发明前端解缠、除胶和促溶过程。

29、（5）本发明所提供的方法适用性和实际应用价值较好。本发明所提供的方法已在5000k高分子量peo和peg6000组成的高难度缓释基质中得到验证，三批市售样品测定的总体rsd为0.99%，具有良好的批间稳定性。该方法亦可适用于含peo、hpmc、hpc中的一种或多种亲水凝胶骨架的缓释制剂，为游离l-谷氨酸的常规质量控制提供了一种准确、稳定且仪器友好的样品前处理方案。