一种源自人参属的中药材中游离氨基酸的含量测定方法及其应用

本发明涉及氨基酸定量检测，尤其涉及一种源自人参属的中药材中游离氨基酸的含量测定方法及其应用。

背景技术：

1、氨基酸在生物体内发挥着构建蛋白质、参与代谢、调节生理功能等多种作用，在生物体中扮演着重要角色。在20种基本氨基酸中，人类可以合成其中11种。另外9种氨基酸，即苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，则必须从食物中摄取，称为必需氨基酸。源自人参属的中药材富含多种氨基酸，其中三七素在止血及增加血小板数目方面表现出显著药理活性，是三七中止血活性最强的单体成分。并且研究发现，不同人参属中药材所含氨基酸的种类和含量存在差异。因此，氨基酸的含量可作为评估人参产品质量的一个重要方面。此外，源自人参属的中药材中氨基酸的定量分析结果还可用于辅助研究其发挥药理作用及保健功能的机理。

2、目前，已有多种用于鉴定和测定人参属中药材中氨基酸的分析方法被开发出来，但由于人参属中药材所含成分复杂，对氨基酸的检测可产生不同程度的干扰，因此，现有的检测人参属中药材中氨基酸的方法往往不易实现氨基酸的准确、痕量检测，或无法涵盖全部氨基酸，或需要较长的检测时间，仍有待进一步研究能实现源自人参属的中药材中更多种类氨基酸的准确、痕量检测且更高效的定量分析方法。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供一种源自人参属的中药材中游离氨基酸的含量测定方法及其应用。该含量测定方法专属性好，灵敏度高，检测时间短，能够实现人参属中药材中20种氨基酸的准确、痕量及高效检测，不仅能用于从氨基酸含量方面评估人参属中药材的质量，还能用于筛选不同人参属中药材的差异标志物。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、本发明第一方面提供一种源自人参属的中药材中游离氨基酸的含量测定方法，采用超高效液相色谱法（uhplc）对待测人参属中药材进行检测；

4、所述高效液相色谱法的色谱条件包括：

5、色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；

6、流动相a为8~12 mmol/l乙酸钠（naoac）水溶液，流动相b为75%~85%v/v乙腈水溶液，进行线性梯度洗脱；

7、所述线性梯度洗脱的程序为：0→9 min，0% b；9→10 min，0%→7.5% b；10→13min，7.5%→8% b；13→15 min，8% b；15→20 min，8%→9% b；20→22 min，9%→22% b；22→30 min，22%→28% b；30→32 min，28%→32% b；32→35 min，32%→40% b；35→37 min，40%→100% b；37→40 min，100% b；40→40.5 min，100%→0% b；40.5→45 min，0% b；

8、流速：0.28~0.32 ml/min。

9、该含量测定方法通过采用特定的流动相并对洗脱程序进行精细优化，特别是对10~20 min的梯度程序通过采用合理的梯度斜率和等度平台，精准拉开了中极性氨基酸的峰间距，缩短了弱极性氨基酸洗脱梯度跨度，从而在保证分离度的同时缩短了总分析时间，使总分析时间仅需45 min，且所有氨基酸峰均达到基线分离，峰形尖锐对称，无明显拖尾或肩峰。方法学考察结果证明，该含量测定方法的专属性好，线性良好且检测限及定量限均极低，精密度、稳定性及重复性均符合方法学要求。因此，该含量测定方法能够满足源自人参属的中药材中氨基酸的准确、痕量、高效检测的需求。

10、优选地，所述源自人参属的中药材包括人参、三七和西洋参。

11、优选地，所述氨基酸包括天冬氨酸（asp）、三七素（den）、谷氨酸（glu）、羟脯氨酸（hyp）、丝氨酸（ser）、谷氨酰胺（gln）、甘氨酸（gly）、组氨酸（his）、γ-氨基丁酸（gaba）、精氨酸（arg）、丙氨酸（ala）、脯氨酸（pro）、酪氨酸（tyr）、缬氨酸（val）、蛋氨酸（met）、异亮氨酸（ile）、亮氨酸（leu）、苯丙氨酸（phe）、色氨酸（try）和赖氨酸（lys）。

12、进一步优选地，所述氨基酸包括天冬氨酸、三七素、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸和赖氨酸。该方法对人参、三七和西洋参中的上述14种氨基酸定量分析的专属性良好。

13、优选地，所述待测样品包括标准品溶液和供试品溶液。

14、进一步优选地，所述标准品溶液的制备方法包括以下操作：将氨基酸标准品溶于水中，然后进行氨基酸衍生化反应，反应完成后，将所得反应液离心，取下层溶液与水混合均匀，过滤，即得所述标准品溶液。

15、进一步优选地，所述供试品溶液的制备方法包括以下操作：将待测源自人参属的中药材粉末进行提取，将所得提取液离心，取上清液；对所得上清液进行氨基酸衍生化反应，反应完成后，将所得反应液离心，取下层溶液与水混合均匀，过滤，即得所述供试品溶液。

16、更进一步优选地，对所述待测源自人参属的中药材粉末进行提取所用的溶剂为水、25%v/v乙醇、50%v/v乙醇或0.1%v/v盐酸水溶液。

17、更进一步优选地，当待测的源自人参属的中药材为人参时，提取所用的溶剂为水；当待测的源自人参属的中药材为三七或西洋参时，提取所用的溶剂为0.1%v/v盐酸水溶液。

18、更进一步优选地，对所述待测源自人参属的中药材粉末进行提取的方法为：先涡旋混合，再进行超声提取、回流提取或浸渍提取。更优选采用先涡旋混合，再超声提取或浸渍提取。

19、其中，超声提取、回流提取或浸渍提取的时间可选0~90 min，如0 min、30 min、40min、60 min、90 min。优选为0~15 min，更优选为15 min。当超声提取、回流提取或浸渍提取的时间为0 min时，表示仅需进行涡旋混合。

20、超声提取或浸渍提取的温度可选25~100℃，如25℃、45℃、75℃、100℃。当待测的源自人参属的中药材为人参，提取所用的溶剂为水时，提取的温度优选采用25℃。当待测的源自人参属的中药材为三七或西洋参，提取所用的溶剂为0.1%v/v盐酸水溶液时，提取的温度优选采用45℃。

21、更进一步优选地，所述提取的方法为：先涡旋混合，再浸渍提取。

22、其中，浸渍提取的时间优选采用0~15 min，更优选为15 min。

23、可选地，所述氨基酸衍生化反应的方法为：向待进行氨基酸衍生化反应的溶液中依次加入三乙胺乙腈溶液和pitc乙腈溶液，混匀，室温下放置1 h，加入正己烷停止反应，萃取出反应试剂。

24、示例性地，对氨基酸标准品溶液进行氨基酸衍生化反应的操作为：向160 μl氨基酸标准品溶液中依次加入三乙胺乙腈溶液、pitc乙腈溶液各100 μl，混匀，室温下放置1 h，加入正己烷400 μl停止反应，萃取出反应试剂。对源自人参属的中药材粉末提取液的上清液进行氨基酸衍生化反应的操作为：向160 μl上清液中依次加入三乙胺乙腈溶液、pitc乙腈溶液各100 μl，混匀，室温下放置1 h，加入正己烷400 μl停止反应，萃取出反应试剂。

25、进一步优选地，制备所述供试品溶液时，第一次离心的参数为：14000 rpm离心20min；第二次离心的参数为：14000 rpm离心15 min。

26、优选地，所述色谱柱为ultimate uhplc aq-c18色谱柱，规格为2.1 × 150 mm，1.8 μm。

27、优选地，所述流动相a为10 mmol/l乙酸钠水溶液。

28、优选地，所述流动相b为80%v/v乙腈水溶液。

29、优选地，所述流速为0.3 ml/min。

30、优选地，所述色谱条件还包括：柱温为35~45℃。进一步优选地，所述柱温为40℃。

31、本发明第二方面提供上述含量测定方法在筛选用于鉴别人参、三七和西洋参的氨基酸类差异标志物中的应用。

32、本发明第三方面提供上述含量测定方法在人参、三七和西洋参质量评价中的应用。

33、本发明利用上述含量测定方法对60批人参、三七和西洋参药材的氨基酸含量进行了检测，经分析发现，不同药材中各氨基酸的占比不同，而同一药材不同批次间氨基酸组成模式相对稳定，只存在细微差异。该分析结果证明源自人参属的不同中药材具有各自特征性的氨基酸谱，游离氨基酸组成特征可作为人参、西洋参、三七的鉴别与质量评价的依据。

34、本发明的有益效果在于：本发明提供的含量测定方法通过特定的色谱条件使氨基酸色谱峰被良好分离并避免了过长的梯度跨度，且峰型良好。方法学考察结果证明，该含量测定方法的专属性、线性、精密度、稳定性及重复性均良好，且检测限及定量限均极低。因此，该含量测定方法能够满足源自人参属的中药材中氨基酸的准确、痕量、高效检测，可用于从氨基酸含量方面评估源自人参属的中药材的质量。基于该方法，本发明还发现了源自人参属的不同中药材具有各自特征性的氨基酸谱，并筛选出可用于区分人参、三七和西洋参的关键差异标志物：精氨酸、γ-氨基丁酸、三七素、谷氨酰胺。人参、三七和西洋参中游离氨基酸组成的差异性特征和特征性氨基酸谱可为该三种药材的鉴别及质量评价提供重要依据。