一种双染免疫组化方法及其试剂盒与流程

本发明属于免疫检测，具体涉及一种双染免疫组化方法。

背景技术：

1、现有技术公开：ck5/6和p63鸡尾酒抗体是免疫组化中常用的双染组合，主要用于乳腺癌病理诊断中浸润性乳腺癌与原位癌的鉴别。鉴别原理ck5/6：正常乳腺基底细胞呈阳性，原位癌时可见环状阳性染色包绕肿瘤细胞，浸润性腺癌中表达缺失。p63：正常乳腺腺泡基底细胞阳性，良性病变中基底膜连续染色，浸润性乳腺癌多为阴性（仅5%的导管癌可见散在阳性）。这两种标志物的组合检测在多种肿瘤的鉴别诊断中具有重要价值，如乳腺病变中肌上皮细胞的检测、肺鳞癌与腺癌的鉴别诊断、头颈部鳞状细胞癌的诊断、前列腺基底细胞的识别、三阴性乳腺癌分子分型。

2、传统的单染检测方法的局限性：需要连续切片并且分别染色，增加了样本消耗和检测成本；不同切片间的细胞定位比对困难，影响诊断准确性；检测流程耗时，不利于快速病理诊断；小活检样本难以满足多次染色的需求。

3、本发明的应用优势：ck5/6-p63鸡尾酒双染组合可显著缩短免疫组化染色时间、减少染色步骤、并且无需抗原修复。本发明采用非生物素标记的免疫组化检测技术，特异性更强、染色背景更干净，便于快速准确区分肿瘤类型。

4、综上，ck5/6和p63双染方法通过技术创新，在病理诊断的效率、准确性、样本节约和结果分析层面都带来了显著提升，并借助术中快速应用直接影响了临床手术决策。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种双染免疫组化方法，颜色对比显著，染色步骤少，免抗原修复，且特异性更强、染色背景更干净。

2、本发明提供了如下的技术方案：

3、一种双染免疫组化方法的试剂盒，包括氧化物酶阻断剂、ck5/6&p63鸡尾酒抗体、多酶信号放大系统、第一显色系统、第二显色系统和苏木素染料；其中，第一显色系统用于p63检测、第二显色系统用于ck5/6检测。

4、一种双染免疫组化方法，如下：

5、s1、获取新鲜组织冰冻切片，切片厚度3～5μm；

6、s2、使用10%中性缓冲福尔马林固定0.5～1.5分钟；

7、s2、使用过氧化物酶阻断剂阻断，室温孵育0.5～1.5分钟；

8、s3、滴加ck5/6与p63鸡尾酒抗体，室温孵育4～6分钟；

9、s4、滴加多酶信号放大系统，室温孵育3～5分钟；

10、s5、依次进行第一显色系统显色1～3分钟，tbs冲洗；第二显色系统：快红显色液显色5～7分钟，tbs终止；

11、s6、苏木素复染后通过无水乙醇脱水封片；苏木素复染20秒后酒精梯度脱水，中性树胶封片即可。

12、优选的，切片厚度4μm；使用10%中性缓冲福尔马林固定1分钟；

13、优选的，ck5/6与p63鸡尾酒抗体为鼠抗ck5/6、兔抗p63。

14、优选的，使用过氧化物酶阻断剂室温孵育1分钟；滴加ck5/6与p63鸡尾酒抗体，室温孵育5分钟；滴加多酶信号放大系统，室温孵育4分钟。

15、优选的，多酶信号放大系统含hrp-羊抗兔与ap-羊抗鼠。

16、优选的，第一显色系统为采用dab显色液显色2分钟；第二显色系统为采用快红显色液显色6分钟。

17、优选的，应用于乳腺良恶性病变普通导管增生与导管原位癌组织染色，并应用于辅助识别鳞状细胞癌细胞组织、基底样乳腺癌细胞组织。

18、本发明的有益效果：

19、1、本发明采用双显色系统，全景显示两个目标抗原且颜色对比显著；

20、2、本发明采用一抗鸡尾酒组合抗体，染色步骤少；

21、3、本发明免抗原修复，适用于新鲜冰冻组织，避免传统福尔马林长期固定导致的抗原遮蔽。

22、4、本发明采用非生物素标记的免疫组化检测技术，特异性更强、染色背景更干净。

1.一种双染免疫组化方法的试剂盒，包括氧化物酶阻断剂、ck5/6&p63鸡尾酒抗体、多酶信号放大系统、第一显色系统、第二显色系统和苏木素染料；其中，第一显色系统用于p63检测、第二显色系统用于ck5/6检测。

2.根据权利要求1所述的一种双染免疫组化方法的试剂盒，双染免疫组化方法，如下：

3.根据权利要求2所述的一种双染免疫组化方法，其特征在于：切片厚度4μm；使用10%中性缓冲福尔马林固定1分钟。

4.根据权利要求2所述的一种双染免疫组化方法，其特征在于：ck5/6与p63鸡尾酒抗体为鼠抗ck5/6、兔抗p63。

5.根据权利要求2所述的一种双染免疫组化方法，其特征在于：使用过氧化物酶阻断剂室温孵育1分钟；滴加ck5/6与p63鸡尾酒抗体，室温孵育5分钟；滴加多酶信号放大系统，室温孵育4分钟。

6.根据权利要求2所述的一种双染免疫组化方法，其特征在于：多酶信号放大系统含hrp-羊抗兔与ap-羊抗鼠。

7.根据权利要求2所述的一种双染免疫组化方法，其特征在于：第一显色系统为采用dab显色液显色2分钟；第二显色系统为采用快红显色液显色6分钟。

8.根据权利要求2所述的一种双染免疫组化方法，其特征在于：应用于乳腺良恶性病变普通导管增生与导管原位癌组织染色，并应用于辅助识别鳞状细胞癌细胞组织、基底样乳腺癌细胞组织。

9.根据权利要求2至8任一项所述的一种双染免疫组化方法，用于双染免疫组化方法的试剂盒，其特征在于：包括氧化物酶阻断剂、ck5/6&p63鸡尾酒抗体、多酶信号放大系统、第一显色系统、第二显色系统和苏木素染料；其中，第一显色系统用于p63检测、第二显色系统用于ck5/6。