参芪醒脑颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与流程

本发明属于中药制剂分析领域，具体涉及一种参芪醒脑颗粒指纹图谱建立方法及其指纹图谱。

背景技术：

1、参芪醒脑颗粒是总结医院长期临床用药经验基础上提炼而得的治疗老年痴呆常用方剂，由黄芪、人参、丹参、泽泻、黄芩等药味组成，具有显著的临床治疗效果。本方中黄芪、人参为君药，以遵循《黄帝内经》中“精不足者，补之以味，皆上行至脑，以为生化之源”。黄芪补诸虚不足，壮脾胃，使脾气化功能得复，则水谷精微濡养脑窍，气血津精上荣髓海，则脑得所养、神机得用。臣以丹参等，活血祛瘀、凉血消痈、除烦安神、泄热渗湿、化浊降脂。佐以黄芩等，清热燥湿、泻火解毒，苦寒可直折君火，以去除体内内生之痰毒、瘀毒、热毒。诸药合用，益气生髓、活血祛瘀通络，化湿祛浊，清热解毒，瘀血、痰浊、湿热、邪毒得消而邪去正安，既可补肾精之不足而填充脑髓，又可使气血运行通畅，杜绝痰浊、血瘀等病理因素的产生，又可使产生之痰浊、瘀血消散，并使内生之痰浊瘀血等蕴积日久转化成热毒消解。

2、参芪醒脑颗粒是中药复方制剂，含多味中药且化学成分复杂，对其进行有效的质量控制是保证其临床疗效的重要基础。目前，尚未见有专利公开及文献报道参芪醒脑颗粒指纹图谱建立，其药效成分尚不明确，同时缺乏有关参芪醒脑颗粒更为综合、全面的质量控制研究。为保证并稳定产品质量，需要对其质量检测和控制法进行全面地研究。中药指纹图谱能够较为全面地反映中药制剂内在整体质量，可有效反映参芪醒脑颗粒化学成分的整体性和复杂性，对制剂质量进行全面地评价和控制，进而保证临床用药的安全性与有效性。

技术实现思路

1、针对现有参芪醒脑颗粒质量检测方法的不足，本发明的目的是提供一种参芪醒脑颗粒指纹图谱建立方法。具体来说，该方法将参芪醒脑颗粒制备成供试品溶液，经过hplc分离检测，从而获得参芪醒脑颗粒hplc标准指纹图谱，实现全方位多方面检测，完善其质量检测体系，进而为参芪醒脑颗粒的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。

2、本发明一种参芪醒脑颗粒hplc指纹图谱的建立方法，包括下列步骤：

3、a、供试品溶液的制备：取参芪醒脑颗粒，加入30%-70%甲醇，超声提取15-40min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

4、b、对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芩苷、丹酚酸b、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、隐丹参酮、丹参酮i和丹参酮iia对照品适量，加入30%-70%甲醇溶解后定容，即得；

5、c、hplc色谱条件的确定：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以0.05%-0.2%磷酸溶液为流动相a，以为乙腈流动相b，采用梯度洗脱；检测波长：200-280nm；流速：0.6-1.0ml/min；柱温：20-30℃，进样量5-10μl；

6、d、指纹图谱的制作：按步骤c色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的参芪醒脑颗粒hplc标准指纹图谱。

7、优选地，步骤a、步骤b所述甲醇溶液为50％甲醇。

8、优选地，步骤a所述超声功率为200-400w，超声频率为30-50khz，超声时间为15-40min。

9、进一步优选，步骤a所述超声功率为250w，超声频率为40khz，超声时间为30min。

10、优选地，步骤c所述梯度洗脱条件为：0-10min，100%-88%a；10-12min，88%-82%a；12-40min，82%-60%a；40-43min，60%-50%a；43%-46min，50%-30%a；46-47min，30%-10%a；47-55min，10%a。

11、优选地，步骤c所述的色谱柱为agilent infinity lab poroshell 120 sb aq色谱柱，规格为4.6×250mm，4.0μm。

12、优选地，步骤c所述流动相a为0.1%磷酸溶液。

13、优选地，步骤c所述检测波长254nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量5μl。

14、本发明的另一个目的，是提供所述参芪醒脑颗粒hplc标准指纹图谱，将15批参芪醒脑颗粒样品，按上述方法制备成供试品溶液，以hplc分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》软件分析，得到参芪醒脑颗粒hplc标准指纹图谱。

15、本发明所得到的指纹图谱，以黄芩苷为参比峰，各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间tr分别为：0.208、0.242、0.274、0.307、0.757、0.763、0.780、0.847、1.014、1.057、1.071、1.087、1.135、1.150、1.174、1.327、1.643、1.674、1.692、1.902、1.915、1.953。

16、通过对照品比对，对各共有峰进行归属和指认，其中，5号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，9号峰为黄芩苷，12号峰为丹酚酸b，16号峰为汉黄芩苷，17号峰为黄芩素，18号峰为汉黄芩素，21号峰为隐丹参酮，22号峰为丹参酮i，23号峰为丹参酮ⅱa。

17、其中5号峰为黄芪中的成分；7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰和20号峰为黄芩中的成分；12号峰、21号峰、22号峰和23号峰为丹参中的成分；其中1号峰、2号峰、3号峰、4号峰和6号峰为人参、黄芪、丹参、黄芩和泽泻的共有成分。

18、与现有技术相比，本发明的技术方案取得了以下有益技术效果：

19、1）本发明建立的参芪醒脑颗粒hplc指纹图谱检测方法，根据参芪醒脑颗粒化学成分的特点，优选最佳梯度洗脱程序及检测波长等，解决了特征峰难以分开及杂质峰干扰大的难题，使所得的指纹图谱分离度高、峰形好，能更全面、准确地评价参芪醒脑颗粒的质量。

20、2）本发明建立了参芪醒脑颗粒指纹图谱，确定了23个共有峰，并指认了9个成分，分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芩苷、丹酚酸b、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、隐丹参酮、丹参酮i和丹参酮ⅱa。通过比对参芪醒脑颗粒中各阴性样品色谱峰，对这23个色谱峰进行归属确证。15批参芪醒脑颗粒指纹图谱相似度在0.993～1.000之间，进一步阐明了参芪醒脑颗粒的化学物质基础。

21、3）本发明建立的参芪醒脑颗粒hplc指纹图谱克服了现有技术检测指标单一、不能反映内在质量的缺点，所提供的参芪醒脑颗粒hplc指纹图谱建立方法精密度高、重现性好，通过对比所得指纹图谱中共有峰的有无，可对参芪醒脑颗粒的质量进行全面评价，有效地保证了成品的质量。

1.一种参芪醒脑颗粒hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a、步骤b所述甲醇溶液为50％甲醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a所述超声功率为200-400w，超声频率为30-50khz，超声时间为15-40min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a所述超声功率为250w，超声频率为40khz，超声时间为30min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述梯度洗脱条件为：0-10min，100%-88%a；10-12min，88%-82%a；12-40min，82%-60%a；40-43min，60%-50%a；43%-46min，50%-30%a；46-47min，30%-10%a；47-55min，10%a。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述的色谱柱为agilent infinitylab poroshell 120 sb aq色谱柱，规格为4.6×250mm，4.0μm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述流动相a为0.1%磷酸溶液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c所述流动相检测波长254nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量5μl。

9.如权利要求1-8中任一项所述参芪醒脑颗粒的指纹图谱，其特征在于，指纹图谱包括23个共有峰，以黄芩苷为参比峰，各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：

10.根据权利要求9所述的指纹图谱，其特征在于，对各共有峰进行归属和指认，5号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，9号峰为黄芩苷，12号峰为丹酚酸b，16号峰为汉黄芩苷，17号峰为黄芩素，18号峰为汉黄芩素，21号峰为隐丹参酮，22号峰为丹参酮i，23号峰为丹参酮ⅱa。