一种灵芝口服液的指纹图谱的构建方法和灵芝多糖含量的检测方法与流程

本发明涉及分析检测，具体涉及一种灵芝口服液的指纹图谱的构建方法和灵芝多糖含量的检测方法。

背景技术：

1、灵芝口服液具有健脾和胃和宁心安神的作用，用于心脾两虚的神经衰弱，例如失眠、健忘、精神不振、倦怠乏力等。因其具有良好的医用价值，现已被推广使用，故而对其质检需要加强。研究表明，灵芝的主要有效成分包括多糖、萜类、甾醇和生物碱类等物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗惊厥、降血脂等多种药理作用。因此，检测灵芝口服液中的多糖以及萜类具有重要的医药。

2、凝胶色谱法（gpc/sec）是分析多糖分子量及其分布的常用技术，目前已广泛应用于多种植物多糖、真菌多糖的质量控制中。高效液相色谱（hplc）是分析灵芝酸a的常用技术。

3、然而，灵芝口服液作为一种复合制剂，其基质成分复杂，除目标多糖和灵芝酸a外，还含有多种其他萜类等干扰物质，直接套用已有的植物多糖凝胶色谱分析方法以及灵芝酸a的hplc检测方法，往往面临色谱峰分离度差、基线漂移严重、保留时间重复性不佳等问题，难以获得稳定、可重现的多糖特征图谱。例如，相关技术公开了灵芝饮片标准汤剂制备及质量分析方法，其色谱条件如下：色谱柱：thermo-c18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（a）-0.1%乙酸（b），采用梯度洗脱（0~20min，72%~68%b；20~40min，68%~64%b）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量为10μl；检测波长：256nm；理论板数按灵芝酸a计算应不低于3000。然而，该色谱条件下灵芝口服液中的灵芝酸a不出峰。

4、因此，亟需建立一种适用于灵芝口服液的指纹图谱构建方法，以实现对其多糖成分和萜类成分（例如灵芝酸a）的整体表征和有效鉴别，为该类口服液的质量控制提供可靠的技术手段。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种灵芝口服液的指纹图谱的构建方法。本发构建的指纹图谱能够有效反映灵芝口服液的整体质量和有效鉴别。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种灵芝口服液的指纹图谱的构建方法，所述指纹图谱包括萜类指纹图谱和灵芝多糖指纹图谱；

4、所述萜类指纹图谱的构建方法包括以下步骤：

5、将灵芝口服液进行水稀释，得到萜类供试品溶液；

6、将所述萜类供试品溶液和灵芝酸a对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，分别得到供试品液相图谱和对照品液相图谱；

7、所述高效液相色谱检测的条件包括：色谱柱为c18色谱柱；流动相体系包括流动相a和流动相b，所述流动相a为乙腈，所述流动相b为体积浓度为0.8~0.12%的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：

8、0~25min，所述流动相a的体积分数由27~28.5%增加至29~32%；

9、25~50min，所述流动相a的体积分数由29~32%增加至37~41%；

10、50~60min，所述流动相a的体积分数由37~41%增加至58~62%；

11、60~70min，所述流动相a的体积分数由58~62%减少至27~28.5%；

12、将所述供试品液相图谱与对照品液相图谱的保留时间进行比对，得到萜类指纹图谱；

13、所述灵芝多糖指纹图谱的构建方法包括以下步骤：

14、将灵芝口服液用热水溶解，使用乙醇进行沉淀，得到灵芝粗多糖；使用浓度为0.1~0.3mol/l的氯化钠水溶液溶解所述灵芝粗多糖，得到灵芝多糖供试品溶液；

15、将所述指纹图谱和灵芝多糖对照品溶液分别进行凝胶色谱检测，分别得到供试品凝胶图谱和对照品凝胶图谱；凝胶色谱检测的流动相包括浓度为0.1~0.3mol/l的氯化钠水溶液；

16、将所述供试品凝胶图谱与对照品凝胶图谱的分子量进行比对，得到灵芝多糖指纹图谱。

17、优选的，所述高效液相色谱检测的条件还包括：色谱柱为zafex c18；柱温为25~35℃；流动相流速为0.8~1.2ml/min；进样量为5~15μl；检测波长为256nm。

18、优选的，所述灵芝口服液与稀释用水的体积比为1：0.5~1.5；

19、所述稀释后还包括将所述稀释得到的稀释液进行离心分离。

20、优选的，所述灵芝酸a对照品溶液中灵芝酸a对照品的浓度为0.2~0.5mg/ml，溶剂包括甲醇。

21、优选的，所述凝胶色谱检测的条件还包括：色谱柱为monomix mc10-sec色谱柱；检测池温度为35~45℃；柱温为35~45℃；流动相流速为0.3~0.7ml/min；进样量为20~80μl。

22、优选的，所述灵芝口服液与热水的用量比为1g：10~30ml；

23、所述灵芝口服液与沉淀用乙醇的用量比为1g：200~400ml；

24、所述沉淀的温度为2~6℃，时间为8~16h；

25、所述灵芝口服液与溶解用氯化钠水溶液的用量比为1g：30~70ml。

26、所述沉淀后还包括：将所述沉淀后的体系依次进行离心分离，将所得固体组分进行乙醇洗涤后除乙醇。

27、优选的，所述灵芝多糖对照品溶液中的灵芝多糖对照品包括右旋糖苷分子量标准套，所述右旋糖苷分子量标准套包括分子量分别为180、2700、5250、9750、13050和36800的右旋糖苷；

28、所述灵芝多糖对照品溶液中的溶剂包括浓度为0.1~0.3mol/l的氯化钠水溶液。

29、本发明还提供了一种灵芝口服液中灵芝多糖含量的检测方法，包括以下步骤：

30、将灵芝口服液和乙醇混合，进行沉淀，得到沉淀物，将所述沉淀物溶解于水中，得到供试品溶液；所述沉淀的次数为3~5次；

31、测试所述供试品溶液的吸光度，根据所述吸光度和吸光度-浓度标准曲线获得灵芝口服液中灵芝多糖含量的测试结果；所述吸光度-浓度标准曲线以葡萄糖的浓度为自变量，以吸光度为因变量。

32、优选的，所述沉淀的温度为2~8℃，单次沉淀的时间为30~60min；

33、所述溶解在超声条件下进行，所述溶解的时间为15~30min；

34、所述吸光度的测试方法包括苯酚硫酸法或硫酸蒽酮法。

35、本发明还提供了上述技术方案所述的灵芝口服液的指纹图谱的构建方法或上述技术方案所述的灵芝口服液中灵芝多糖含量的检测方法在灵芝口服液质量控制中的应用。

36、本发明构建的指纹图谱包含了萜类物质（例如灵芝酸a）和灵芝多糖两类有效活性成分，能够全面、准确、综合反映灵芝口服液的整体质量，为灵芝口服液质量控制提供了全面的鉴别评价方法，从而更好地保证灵芝口服液的质量稳定性、一致性和可控性，为灵芝口服液内在的药效提升提提供了技术支持。

37、现有的灵芝口服液中灵芝多糖含量的检测方法重现性差。本发明提供的检测方法显色结果稳定且定量准确，本发明提供检测方法重复性好，能够实现对于灵芝口服液中灵芝多糖含量的准确、高灵敏度检测，为灵芝口服液质量控制提供了全面的鉴别评价方法，从而更好地保证灵芝口服液的质量稳定性、一致性和可控性，为灵芝口服液内在的药效提升提提供了技术支持。