一种包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物HPLC-DAD指纹图谱构建方法及其应用与流程

本发明涉及医药，具体涉及一种包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物hplc-dad指纹图谱构建方法及其应用。

背景技术：

1、

2、

3、特征图谱是基于中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。中药特征图谱能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制，尤其适用于有效成分不完全明确或不需要完全明确的情况下，对中药材及中药产品进行质量控制。中药特征图谱除能用于考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工、储存时间等因素，以提供依据鉴别生产前原料药材的真伪优劣，更可用于中药生产过程的质量控制：追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品的各批次间质量的一致性及稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，特征图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。

4、目前，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物的化学成分进行全面地分析以及特征图谱研究，现有技术中，仅对该中药复方中的单一成分进行质量分析，尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况，无法对其生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效，故需采用能全面控制本发明的中药复方整体质量的特征图谱的质控方法控制其关键质量。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物hplc-dad指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：

2、中药组合物供试品溶液的制备：取适量的包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物煎液，离心，取上清液置于容器中，加入溶剂摇匀，滤过，取续滤液，得到该中药组合物供试品溶液；其中，该中药组合物包括当归、黄连、生地、牡丹皮和升麻；

3、对照品溶液的制备：称取适量的芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、盐酸小檗碱和丹皮酚对照品，添加甲醇溶液配制成芍药苷、阿魏酸、异阿魏酸、盐酸小檗碱和丹皮酚浓度各为0.05~0.2 mg/ml的该对照品溶液；

4、根据高效液相检测该中药组合物供试品溶液、该对照品溶液、阴性样品溶液、单味药材对照溶液和空白溶剂的结果，获得中药组合物hplc-dad指纹图谱；

5、该高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相a选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相b为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0~10 min，88%b→82%b；10~14 min，82%b→78%b；14~30 min，78%b→75%b；30~55 min，75%b→67%b；55~90 min，67%b→40%b；90~91 min，40%b→5%b；91~100 min，5%b；100~101 min，53%b→88%b；101~110 min，88%b；流速为0.8~1.2 ml/min，柱温为25~35℃，吸收波长为190~400 nm，进样量为5~20 μl。

6、进一步地，该生地为酒生地。

7、进一步地，该离心的转速为2000~6000 r/min，例如约4000 r/min。

8、进一步地，该离心的时间为5~20 min，例如约10 min。

9、进一步地，该溶剂为甲醇和磷酸的混合溶液。

10、进一步地，该混合溶液中甲醇与磷酸的体积之比为（90~110）：（0.5~2），例如约100：约1。

11、进一步地，该容器为50 ml量瓶。

12、进一步地，该上清液与该溶剂的体积之比值为0.5~2，例如约1。

13、进一步地，该上清液的体积为20~30 ml，例如约25 ml。

14、进一步地，该溶剂的体积为20~30 ml，例如约25 ml。

15、进一步地，该阴性样品溶液的制备方法为：分别称取适量的缺少当归、黄连、生地、牡丹皮或升麻的中药组合物煎液，之后的步骤与该供试品溶液的制备方法相同。

16、进一步地，该单味药材对照溶液的制备方法为：分别称取适量的当归、黄连、生地、牡丹皮或升麻单味药材煎液，之后的步骤与该供试品溶液的制备方法相同。

17、进一步地，该空白溶剂为约50%甲醇溶液。

18、进一步地，包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物煎液的制备方法包括：称取适量的当归、黄连、生地、牡丹皮和升麻药材，粉碎为细末，加入水进行浸泡，武火煎煮至沸腾，文火煎煮一段时间得到煎煮液，滤过，得到该包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物煎液。

19、进一步地，该单味药材煎液的制备方法包括：称取适量的单味药材，粉碎为细末，加入水进行浸泡，武火煎煮至沸腾，文火煎煮一段时间得到煎煮液，滤过，得到该单味药材煎液。

20、进一步地，该当归、黄连、生地、牡丹皮和升麻的质量之和与该水的质量/体积（g/ml）之比值为0.01~0.05，例如约0.022。

21、进一步地，该单味药材与该水的质量/体积（g/ml）之比值为0.01~0.05，例如约0.022。

22、进一步地，该水的体积为400~500 ml，例如约450 ml。

23、进一步地，该当归、该黄连、该生地、该牡丹皮和该升麻之间的质量之比为（1~2）：（1~2）：（1~2）：（1~3）：（3~5）。

24、进一步地，该当归、该黄连、该生地、该牡丹皮和该升麻之间的质量之比为约1.24：约1.24：约1.24：约2.07：约4.13。

25、进一步地，该当归的质量为1~2 g，例如约1.24 g。

26、进一步地，该黄连的质量为1~2 g，例如约1.24 g。

27、进一步地，该生地的质量为1~2 g，例如约1.24 g。

28、进一步地，该牡丹皮的质量为1~3 g，例如约2.07 g。

29、进一步地，该升麻的质量为3~5 g，例如约4.13 g。

30、进一步地，该浸泡的时间为5~20 min，例如约10 min。

31、进一步地，该武火的功率为1000~1400w，例如约1200w。

32、进一步地，该文火的功率为300~500w，例如约400w。

33、进一步地，该文火煎煮的时间为20~30 min，例如25 min。

34、进一步地，该水与该煎煮液的体积之比值为1~2，例如约1.5。

35、进一步地，该煎煮液的体积为200~400 ml，例如约300 ml。

36、进一步地，该滤过的孔径为300目。

37、进一步地，该细末为能够全部通过四号筛，但混有能通过五号筛不超过60%的粉末。

38、进一步地，在该对照品溶液的制备中，该甲醇溶液的体积百分比浓度为40%~60%，例如约50%。

39、进一步地，该对照品溶液中芍药苷的浓度为约0.1 mg/ml。

40、进一步地，该对照品溶液中阿魏酸的浓度为约0.1 mg/ml。

41、进一步地，该对照品溶液中异阿魏酸的浓度为约0.1 mg/ml。

42、进一步地，该对照品溶液中盐酸小檗碱的浓度为约0.1 mg/ml。

43、进一步地，该对照品溶液中丹皮酚的浓度为约0.1 mg/ml。

44、进一步地，该流速为0.9~1.1 ml/min，例如约1.0 ml/min。

45、进一步地，该柱温为28~35℃，例如约30℃。

46、进一步地，该吸收波长为约230 nm。

47、进一步地，该进样量为约10 μl。

48、进一步地，该色谱柱为agilent 5tc-c18（2）色谱柱。

49、进一步地，该色谱柱的规格：柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm。

50、进一步地，该盐酸小檗碱对应的色谱峰的理论板数不低于25000。

51、进一步地，流动相a为甲醇。

52、进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。

53、进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。

54、进一步地，该酸水溶液为0.05%~0.12%的酸水溶液。

55、进一步地，该酸水溶液为0.05%~0.12%的磷酸水溶液。

56、进一步地，该酸水溶液为约0.1%的磷酸水溶液。

57、进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或磷酸盐水溶液。

58、进一步地，该缓冲盐水溶液的ph值不大于7.0。

59、进一步地，在该吸收波长为230 nm时，该hplc-dad指纹图谱包括1-14号峰，该1-14号峰的保留时间分别对应为约10.205 min、约12.634 min、约18.660 min、约22.748 min、约33.374 min、约45.047 min、约51.654 min、约54.884 min、约60.412 min、约67.933min、约69.943 min、约74.645 min、约84.124 min和约86.761 min。

60、进一步地，在该吸收波长为230 nm时，该hplc-dad指纹图谱包括1-14号峰，其中10号峰作为参照峰，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、11号峰、12号峰、13号峰和14号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.16、约0.20、约0.29、约0.36、约0.52、约0.69、约0.78、约0.82、约0.88、约1.03、约1.11、约1.26和约1.31。

61、进一步地，在该吸收波长为230 nm时，5号峰为芍药苷，6号峰为阿魏酸，7号峰为异阿魏酸，10号峰为盐酸小檗碱，12号峰为丹皮酚。

62、进一步地，在该吸收波长为230 nm时，1号峰来自黄连药材，2号峰来自升麻药材，3号峰来自牡丹皮药材，4号峰来自黄连药材，5号峰来自牡丹皮药材，6号峰来自当归药材和升麻药材，7号峰来自升麻药材，8号峰来自黄连药材，9号峰来自黄连药材，10号峰来自黄连药材，11号峰来自黄连药材，12号峰来自牡丹皮药材，13号峰来自升麻药材，14号峰来自牡丹皮药材。

63、根据本发明的另一个方面，提供了一种包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物的质量控制方法，该质量控制方法包括如下步骤：

64、（1）根据上述hplc-dad指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准hplc-dad指纹图谱；

65、（2）取中药组合物供试品溶液，根据上述hplc-dad指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药组合物待测样品hplc-dad指纹图谱；以及

66、（3）将步骤（2）所得到的该中药组合物待测样品hplc-dad指纹图谱与步骤（1）所得到的该中药组合物基准样品标准hplc-dad指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。

67、进一步地，该符合要求包括以下的一种或多种：

68、（1）该中药组合物待测样品hplc-dad指纹图谱中呈现出14个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在该中药组合物基准样品标准hplc-dad指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10%之内；

69、（2）以盐酸小檗碱为s峰，中药组合物待测样品hplc-dad指纹图谱中的各特征色谱峰与s峰的相对保留时间在该中药组合物基准样品标准hplc-dad指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10%之内；其中，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、11号峰、12号峰、13号峰和14号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.16、约0.20、约0.29、约0.36、约0.52、约0.69、约0.78、约0.82、约0.88、约1.03、约1.11、约1.26和约1.31；以及

70、（3）按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药组合物待测样品hplc-dad指纹图谱与该中药组合物基准样品标准hplc-dad指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

71、根据本发明的另一个方面，提供了一种上述构建方法或上述质量控制方法在包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。

72、本发明的有益效果：

73、简而言之，本发明提供了一种包含黄连、升麻和牡丹皮的中药组合物基准样品的特征图谱测定和质量控制方法，该方法确认了14个共有特征峰，条件简单，分析时间短，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续制剂的质量控制提供了重要的参考依据，确保产品的质量稳定，保障中药复方的疗效，让该中药复方更好地为人类生命健康服务。

74、具体而言，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

75、（1）建立本发明中药复方基准样品的特征图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制本发明中药复方基准样品的内在质量，保证了药物的疗效，利用现代药物研究的主要手段，实现精品传承经典，使经典名方得到了更为正规的质量控制；

76、（2）本发明中药复方基准样品中化学成分复杂，要实现其特征峰的分离难度大，本发明在建立起特征图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题；

77、（3）本发明在建立本发明中药复方基准样品的特征图谱过程中，确认了14个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积和相似度进行了研究，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续复方制剂的质量控制提供重要的参考依据和质量参照；

78、（4）以本发明中药复方基准样品中各有效成分特征图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定本发明中药复方基准样品整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，为完整、准确评价本发明中药复方基准样品的质量提供了新的方法和手段；

79、（5）本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。