一种奶中7种ω-3多不饱和脂肪酸含量的测定方法

本发明涉及乳制品脂肪酸检测，特别是涉及一种奶中7种ω-3多不饱和脂肪酸含量的测定方法。

背景技术：

1、ω-3多不饱和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 pufas）是一类人体必需的功能性脂肪酸，主要包括α-亚麻酸（ala）、二十碳五烯酸（epa）、二十二碳五烯酸（dpa）、二十二碳六烯酸（dha）及二十碳三烯酸（ete）等。它们在抗炎、抗癌、促进神经系统和视觉功能发育、降低心血管疾病风险和减缓神经退行性疾病进程等方面具有重要意义。牛奶作为一种日常高消费、易吸收且安全的食物来源，其所含的ω-3 pufas具有独特的生物学优势和应用潜力，在乳制品领域，提高牛奶及其制品中ω-3 pufas的含量已被认为是改善人类膳食结构和促进健康的重要途径。

2、长期以来，国内缺乏针对奶及奶制品中ω-3 pufas的高灵敏度、高通量检测标准，目前针对食品中ω-3 pufas的测定主要采用国家标准《gb 5009.168—2016 食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》，该方法虽然能够实现脂肪酸定性与定量分析，但存在分析步骤繁琐、前处理时间长、检测周期过慢、定量限较高、ω-3 pufas种类不全等问题，难以满足乳品对ω-3 pufas快速、灵敏、准确检测的需求。

3、另外，方国臻等人于《气相色谱-质谱法测定婴幼儿奶粉中多不饱和脂肪酸的方法研究》（2010年2月，中国食品学报，vol.10，no.1）中，选定hp-88型脂肪酸专用色谱柱分离目标脂肪酸，使用加速溶剂萃取装置萃取奶粉中的多不饱和脂肪酸，以二十三烷酸作为内标物，仅能检测3种ω-3多元不饱和脂肪酸（ala、epa和dha），且该方法是针对婴幼儿配方乳粉基质，无法适用于生乳、巴氏杀菌乳和灭菌乳等奶制品；更为关键的是，该方法主要关注ω-3多元不饱和脂肪酸的检出能力，仅能判断目标物是否存在（高于或低于此限），‌无法对结果进行准确定量，也无法满足特定的准确度和精密度‌。‌‌

4、综上所述，本领域亟需建立一套科学、准确、灵敏的方法用于检测和监测牛奶及其制品中的ω-3 pufas含量，不仅对于优化乳制品生产、提升营养价值以及指导人群健康膳食具有重要意义，而且也为营养评价、功能研究和健康风险提供可靠的技术手段。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种奶中7种ω-3多不饱和脂肪酸含量的测定方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

3、一种奶中7种ω-3多不饱和脂肪酸含量的测定方法，其中，所述7种ω-3多不饱和脂肪酸分别为c18:3n3、c18:4n3、c20:3n3、c20:4n3、 c20:5n3、c22:5n3和c22:6n3，采用气相色谱质谱法进行测定，内标物为十九碳酸甲酯；

4、具体包括以下步骤：

5、（1）配制ω-3多不饱和脂肪酸标准系列工作溶液

6、①ω-3多不饱和脂肪酸标准储备溶液和内标十九碳酸甲酯标准储备溶液的配制

7、分别准确称取10 mg ω-3多不饱和脂肪酸和20 mg十九碳酸甲酯，精确至0.01mg，分别置于10 ml和100 ml棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配制成浓度为1000 μg/ml的ω-3多不饱和脂肪酸标准储备溶液和200 μg/ml十九碳酸甲酯标准储备溶液；将溶液转移至棕色试剂瓶中，于-20℃保存；

8、②ω-3多不饱和脂肪酸标准中间溶液和内标十九碳酸甲酯中间溶液的配制

9、分别移取适量浓度为1000 μg/ml的ω-3多不饱和脂肪酸标准储备溶液和200 μg/ml十九碳酸甲酯标准储备溶液，用色谱级正己烷分别稀释成浓度为100 μg/ml的ω-3多不饱和脂肪酸标准中间溶液和40 μg/ml的内标十九碳酸甲酯中间溶液；

10、③标准系列工作溶液

11、分别吸取适量ω-3多不饱和脂肪酸标准中间溶液和50 μl十九碳酸甲酯标准中间溶液(200 μg/ml)于5 ml容量瓶中，用色谱级正己烷稀释定容，配制成500 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、5000 ng/ml的ω-3多不饱和脂肪酸标准系列工作溶液，其中十九碳酸甲酯浓度为2000 ng/ml。

12、（2）水解

13、移取两份乳品试样于15 ml离心管中，准确加入十九碳酸甲酯标准储备溶液50 μl(200 μg/ml)，混匀，加入50 mg焦性没食子酸，再加入1 ml氨水和1 ml乙醇，混匀；将15 ml离心管放入70 ℃~80 ℃水浴中水解20 min，每5 min振荡离心管，使黏附在管壁的颗粒物混入溶液；水解完成后，放置室温冷却。

14、（3）脂肪提取

15、冷却后打开离心管盖，加入4 ml正己烷异丙醇混合溶液，涡旋振荡30 s后，于4℃、12000 r/min离心3 min；将上层正己烷相移至带盖耐高温试管中，再向试样中加正己烷2.6 ml，涡旋10 s，于4 ℃，12000 r/min离心3 min，转移正己烷相到同一带盖耐高温试管，合并2次试样提取液。其中，正己烷异丙醇混合溶液中正己烷和异丙醇的体积比为3:2。

16、（4）皂化和甲酯化

17、向提取液中加入2 ml氢氧化钠-甲醇溶液，拧紧试管盖，摇匀，于50℃水浴皂化20min；冷却至室温后，加入2 ml乙酰氯甲醇溶液，于90 ℃水浴进一步酯化2.5 h；冷却至室温后，在酯化后的溶液中加入5 ml饱和氯化钠溶液，转移上层正己烷相至15 ml离心管中并加入0.5 g无水硫酸钠，涡旋振摇30 s，静置10 min；准确移取上清液，待测定。

18、其中，氢氧化钠-甲醇溶液的浓度配比为20 g/l，即称取2 g 氢氧化钠用甲醇溶解，转移至100 ml 容量瓶中，用甲醇定容。乙酰氯甲醇溶液的浓度配比为10 %，即量取10ml 乙酰氯缓慢注入80 ml 甲醇的烧杯中，转移至100 ml 容量瓶中，用甲醇定容至100 ml。

19、（5）测定

20、①气相色谱条件

21、毛细管色谱柱：中等极性10%氰丙基苯基-聚二甲基硅氧烷固定相色谱柱，柱长20m，内径0.25 mm，膜厚0.18 μm，或性能相当者；

22、进样口温度：250 ℃；

23、程序升温：初始温度140 ℃，保持0.5 min；以20 ℃/min速率升至180 ℃，保持2min；以1.5 ℃/min速率升至200 ℃，保持0 min；以30 ℃/min速率升至220 ℃，保持2 min；总运行时间20.5 min；

24、载气：氦气，纯度≥99.999%；

25、模式：恒压28 psi；

26、分流比：20:1；

27、进样体积：1 μl；

28、②质谱条件

29、电子轰击离子化源：70 ev；

30、离子源温度：230 ℃；

31、传输线温度：230 ℃；

32、四极杆温度：150 ℃；

33、溶剂延迟：4 min。

34、其中，采用sim 模式作为质谱检测策略，以实现对多不饱和脂肪酸甲酯的高选择性和高灵敏度测定：对内标 c19:0 fame 以 m/z 312 为定量离子，辅以 m/z 74、87、143作为定性离子；对所有含多不饱和长链脂肪酸以 m/z 79 为主定量离子，并分别监测其对应的定性离子以实现双重确认；为保证色谱峰获得足够的数据点进行精确积分，按每个sim 扫描段调整驻留时间，使每一峰至少采集 12-15 个点；其中内标c19:0 fame和ω-3多不饱和脂肪酸甲酯定量和定性离子汇总如下表所示，

35、。

36、进一步的，选择内标法和试剂标，方法的定量限确定为 5.0 mg/kg。

37、同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

38、（1）本发明建立了适用于生乳、巴氏杀菌乳、高温杀菌乳和灭菌乳中ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 pufas）的gc-ms检测方法，是首个专门针对奶及奶制品中ω-3 pufas高通量、精准检测的标准方法，填补了行业空白。

39、（2）快速高效：本发明优化了前处理流程，通过乙醇沉淀蛋白、氨水水解、正己烷提取的步骤组合，避免了多次萃取与转移过程造成的目标物损失；试剂用量仅16.6 ml，更加绿色环保；传统方法仅能测定3种ω-3组分，分析时间长达38.83分钟，而本发明分析时间仅需20.5分钟，显著缩短了前处理时间，提高了检测效率。

40、（3）灵敏度高、定量准确：本发明采用gc-ms结合选择离子监测（sim）模式，有效降低了基质干扰，对7种ω-3多不饱和脂肪酸的定量限均可达5.0 mg/kg，优于传统方法，结果准确可靠，能够实现对各类ω-3脂肪酸组分的精准区分和定量分析。

41、下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的奶中7种ω-3多不饱和脂肪酸含量的测定方法作进一步说明。