一种小儿七星茶中钩藤指标成分含量的测定方法及其应用与流程

本发明涉及检测与分析，具体涉及一种小儿七星茶中钩藤指标成分含量的测定方法及其应用。

背景技术：

1、小儿七星茶颗粒是临床常用的经典儿科中成药，由薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草七味中药材配伍制成，组方精妙，具备开胃消滞、清热定惊的核心功效。该制剂主要用于治疗小儿积滞化热所致的消化不良、不思饮食、烦躁易惊、夜寐不安、大便不畅、小便短赤等病症，因药性平和、疗效确切，在儿科临床中应用广泛。方剂中七味药材各司其职、协同配伍，共同构建了制剂的药效物质基础，其中钩藤作为核心臣药，是该方剂清热平肝、息风定惊功效的关键药味，针对性改善小儿积滞化热引发的烦躁惊惕、夜卧不宁等中枢亢奋症状。

2、钩藤的核心药效物质为钩藤碱、异钩藤碱等生物碱类活性成分，也是表征小儿七星茶颗粒平肝定惊药效、评价钩藤药材投料真实性与制剂质量优劣的标志性指标成分，其含量高低直接决定了制剂安神定惊的临床疗效，是小儿七星茶颗粒质量控制中不可或缺的核心检测项目。方剂中其余药味分工明确，山楂、稻芽、薏苡仁富含有机酸、多酚、多糖类物质，主打消食化积、健脾和胃；淡竹叶含异荭草苷等碳苷黄酮，可清心除烦；蝉蜕含氨基酸、甾醇类组分，辅助疏风安神；甘草中甘草酸、甘草苷等三萜皂苷及黄酮类成分，起到健脾调和、清热解毒、调和诸药的作用，多味药材有效成分协同作用，实现了制剂消积、清热、定惊的完整药理作用。

3、目前，小儿七星茶颗粒的现行药典质量标准存在明显的质控短板，仅采用高效液相色谱法对制剂中甘草酸单一成分进行含量限定，完全未对核心定惊药味钩藤的特征生物碱成分进行质量把控，无法有效验证制剂中钩藤药材的投料真实性，也无法量化评价制剂平肝定惊的核心药效水平，质控覆盖面严重缺失，难以全面、精准地管控制剂整体内在质量，极易出现原料投料不达标、成品药效参差不齐等质量问题。

4、现有公开的检测技术虽已针对小儿七星茶颗粒建立了部分药效成分检测方法，但整体检测体系存在明显缺陷，可同步定量检测的标志物仅包含甘草酸、甘草苷、绿原酸、芹菜素、钩藤碱、异钩藤碱等有限5-6种成分，不仅覆盖药味残缺、检测成分数量极少，且针对钩藤指标成分的专属检测方法不完善、针对性不足。现有技术多为多成分同步筛查的通用检测体系，针对钩藤碱、异钩藤碱的色谱分离度、定量精准度较差，极易受到制剂中黄酮、有机酸、三萜皂苷等其他类别成分的基质干扰，无法实现钩藤特征指标成分的精准、专属定量检测。同时，现有方法前处理操作繁琐、分析耗时长，检测稳定性与重复性不佳，难以满足工业生产、质量抽检、科研检测中对小儿七星茶颗粒钩藤药效成分的专属质控需求。

5、检索到的相关专利文献：

6、公开国别中国，公告号cn108627581b，公告日2021.08.31，该文献公开了一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备:准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节ph值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(a)：0.02-0.07%二乙胺-(7-10)mm醋酸铵(b)=40-60:60-40v/v；流速:0.8-1.2ml/min；洗脱时间:35-60分钟；柱温:25-35℃；检测波长:240-250nm；该含量测定方法操作简单、准确反映产品的真实含量，适合产业化日常生产检验。

7、公开国别中国，公告号cn115290769b，公告日2024.05.14，该文献公开了一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，该方法由以下步骤组：成首先配制混合内标溶液、混合标准品溶液和待检测进样液，再按下述方法进行检测:按进样量为1-10ul，柱温为20-40℃的poroshel1 120ec-c18色谱柱进样，接着用由a相和b相组成的流动相以0.15-0.45ml/min的流速并按照规定的程序进行梯度洗脱，同时采用多反应监测分析，获得被检测物以及标准品的谱图;最后将被检测物以及标准品的谱图比对，确定小儿七星茶颗粒中26种有效成分及含量。本方法能同时对小儿七星茶颗粒中26种有效成分进行定性和定量检测，而且具有精密度高和重复性好的优点。

8、检索到的相关非专利文献：

9、期刊名称《中国实验方剂学杂志》，文献名称《小儿七星茶颗粒指纹图谱》，卷号第13卷，公开日期2014.07.29，该文献公开了用高效液相色谱法，设置9段梯度洗脱程序同步测定甘草苷、绿原酸、芹菜素3种成分，整套梯度洗脱流程结合色谱柱平衡至初始流动相，单次检测总时长高达118 min，检测周期冗长，大批量样品检测效率极低。

10、前述文献代表的现有技术至少存在以下未解决的技术问题或缺陷：

11、样品前处理流程繁琐，相关证据为：专利文献专利公告号cn108627581，该文献所记载的检测方法中，待测样品经热水溶解、长时间超声提取后，需氨水碱化，再采用乙酸乙酯多次振摇液-液萃取，操作步骤多、有机溶剂消耗量大；萃取过程易产生乳化效应造成目标成分损失，氨水手动调节ph易引入操作误差，方法稳定性欠佳，不利于工业化批量检验。

12、可检测指标种类有限，相关证据为：专利文献专利公告号cn108627581，该文献所记载的检测方法中，仅能定量钩藤碱、异钩藤碱两种生物碱，无法同步测定喜果苷、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、毛钩藤碱等钩藤特征活性成分，难以完整覆盖钩藤药效物质群，仅选择2种指标成分，标志物覆盖面狭窄。

13、本发明在解决上述问题或克服上述缺陷时，曾遇到以下困难和障碍：

14、中药成分复杂，方法开发过程中为了改善峰形，提高色谱峰分离度，增强检测器的信号响应强度，实验考察了不同流动相添加剂种类以及浓度，以及各组分吸收波长等参数。最后，通过优化梯度洗脱程序，样品中6个目标成分可在58 min内完成基线分离并完成定量分析。

15、综上，当前行业缺乏一种针对性强、分离效果优异、定量准确度高、操作简便高效的专属检测方法，用于精准测定小儿七星茶颗粒中钩藤核心指标成分的含量，无法有效保障含钩藤制剂的药效稳定性与质量均一性。因此，开发一种专属、精准、高效的小儿七星茶中钩藤指标成分含量的测定方法，对完善该制剂质量控制体系、填补现有质控技术漏洞、保障临床用药安全有效具有重要的现实意义与应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供：

2、一种小儿七星茶中钩藤指标成分含量的测定方法，及其相关技术，以解决提升目标峰的分离度、增强信号响应度、改善峰型等技术问题或其组合。

3、术语说明：

4、除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与本发明主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利发明、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。

5、应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明的主题作任何限制。在本发明中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。

6、可在参考文献《中华人民共和国药典》2025年版、《中药制剂分析》（第2版，蔡宝昌主编，高等教育出版社）等中找到对标准术语的定义。

7、除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如单波长恒定检测、程序切换波长法、外标一点法、外标标准曲线法、专属性、精密度、稳定性、回收率、线性考察等方法。

8、除非提出具体定义，本文中使用的各类市售产品的使用，均采用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来进行实施。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。

9、本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-2、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。

10、本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

11、本文所用的术语“小儿七星茶”，指：由薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草七味药材配伍制成的儿科中成药制剂，具有开胃消滞、清热定惊功效。

12、本文所用的术语“hplc-uv”，指：高效液相色谱-紫外检测器联用技术（highperformance liquid chromatography-ultraviolet detector），是以高效液相色谱实现样品组分分离、紫外检测器对目标物质进行定量定性分析的色谱检测方法。

13、本文所用的术语“喜果苷”，指：钩藤中天然存在的吲哚类生物碱单体，英文名称vincosamide，cas号23141-27-7；为小儿七星茶中钩藤药材专属特征标志物之一，属于单萜吲哚生物碱，可作为定性鉴别、定量评价处方中钩藤投料量与内在质量的特征指标。

14、本文所用的术语“异去氢钩藤碱”，指：钩藤特征吲哚生物碱，英文名称isocorynoxeine，cas号51014-29-0；与去氢钩藤碱互为同分异构体，是表征钩藤平肝定惊药效的关键活性组分，为本方法定量检测的钩藤核心指标成分。

15、本文所用的术语“去氢钩藤碱”，指：钩藤标志性单萜吲哚生物碱，英文名称corynoxeine，cas: 630-94-4；分子结构含不饱和双键，具备镇静安神、抗惊厥药理活性，可用于评价小儿七星茶定惊功效物质水平。

16、本文所用的术语“异钩藤碱”，指：钩藤主要活性生物碱，英文名称isorhynchophylline，cas 登记号 6859-01-4；与钩藤碱成对存在，是现行中药质控公认的钩藤定量标志物，直接关联制剂清热平肝、缓解小儿烦躁夜惊的药效。

17、本文所用的术语“钩藤碱”，指：钩藤代表性特征生物碱，英文名称rhynchophylline，cas号76-66-4；为钩藤药材法定质控指标，具有镇静、抗焦虑、舒缓神经作用，是小儿七星茶定惊功效的核心药效物质。

18、本文所用的术语“毛钩藤碱”，指：钩藤属植物特有吲哚生物碱，英文名称hirsutine，cas号7729-23-9；多富集于毛钩藤、大叶钩藤等药用基原，可作为多基原钩藤投料鉴别及整体质量评价的辅助特征指标。

19、第一方面，本发明提供了：一种小儿七星茶中钩藤指标成分含量的测定方法，包括步骤：

20、（1）对照品溶液的制备：将对照品溶于溶剂后制成对照品溶液；

21、（2）供试品溶液的制备：将供试品溶于溶剂后经超声处理后离心，得到供试品溶液；

22、（3）hplc-uv检测：将步骤（1）所得对照品溶液和步骤（2）所得供试品溶液进行hplc-uv检测。

23、其中，步骤（1）和步骤（2）所用的溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；

24、优选地，步骤（1）和步骤（2）所用的溶剂为甲醇。

25、进一步优选地，步骤（1）所用溶剂为色谱甲醇；

26、进一步优选地，步骤（2）所用溶剂为体积分数为30%-100%的甲醇；

27、其中，上述的体积分数为30%-100%，例如30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%，或其任意衍生的范围；

28、更进一步优选地，步骤（2）所用溶剂为体积分数为70%的甲醇。

29、其中，步骤（1）所述对照品溶液的浓度为0.5-2mg/ml，例如0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2mg/ml，或其任意衍生的范围；

30、优选地，步骤（1）所述对照品溶液的浓度为1mg/ml。

31、其中，步骤（2）所述供试品溶于溶剂的浓度为0.1-0.5g/ml，例如0.1g/ml、0.15g/ml、0.2g/ml、0.25g/ml、0.3g/ml、0.35g/ml、0.4g/ml、0.45g/ml、0.5g/ml，或其任意衍生的范围；

32、优选地，步骤（2）所述供试品溶于溶剂的浓度为0.2g/ml。

33、其中，步骤（2）所述超声的频率为20-60khz，例如20khz、25khz、30khz、35khz、40khz、45khz、50khz、55khz、60khz，或其任意衍生的范围；

34、优选地，步骤（2）所述超声的频率为40khz。

35、其中，步骤（2）所述超声的功率200-600w，例如200w、250w、300w、350w、400w、450w、500w、550w、600w，或其任意衍生的范围；

36、优选地，步骤（2）所述超声的功率400w。

37、其中，步骤（2）所述超声的时长为5-60min，例如 5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min，或其任意衍生的范围；

38、优选地，步骤（2）所述超声的时长为30min。

39、其中，步骤（2）所述离心的转速为10000-15000rpm，例如10000rpm、10500rpm、11000rpm、11500rpm、12000rpm、12500rpm、13000rpm、13500rpm、14000rpm、14500rpm、15000rpm，或其任意衍生的范围；

40、优选地，步骤（2）所述离心的转速为14000rpm。

41、其中，步骤（2）所述离心的时长为5-20min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，或其任意衍生的范围；

42、优选地，步骤（2）所述离心的时长为10min。

43、在一些具体的实施方式中，步骤（3）所用色谱柱采用sinopak beh t-c18（250 mm×4.6 mm, 5μm）。

44、其中，步骤（3）所述检测的流动相a选自甲醇、乙腈中的至少一种；

45、优选地，步骤（3）所述检测的流动相a为乙腈。

46、其中，步骤（3）所述检测的流动相b选自水、二乙胺水溶液、三乙胺水溶液和氨水中的至少一种；

47、优选地，步骤（3）所述检测的流动相b为二乙胺水溶液；

48、进一步优选地，所述二乙胺水溶液中二乙胺的重量百分数为0.01%-0.10%，例如0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%，或其任意衍生的范围；

49、更进一步优选地，所述二乙胺水溶液中二乙胺的重量百分数为0.06%。

50、其中，步骤（3）所述检测的梯度洗脱条件如下所示：

51、表1梯度洗脱条件

52、

53、其中，步骤（3）所述检测的柱温选自25-35℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃，或其任意衍生的范围；

54、优选地，步骤（3）所述检测的柱温为30℃。

55、其中，步骤（3）所述检测的进样体积选自5-25μl，例如5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl，或其任意衍生的范围；

56、优选地，步骤（3）所述检测的进样体积为10μl。

57、其中，步骤（3）所述检测的流速选自0.8-1.2ml/min，例如0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min，或其任意衍生的范围；

58、优选地，步骤（3）所述检测的流速为0.9 ml/min。

59、其中，步骤（3）所述检测的波长选自210-250nm，例如210nm、215nm、220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm，或其任意衍生的范围；

60、优选地，步骤（3）所述检测的波长为246nm。

61、基于对本发明的技术问题的进一步解决或同时解决多个技术问题，在本发明第一方面所提供的技术方案中，优选方案包括：

62、第一项优选方案：步骤（3）所述检测的流动相b选自水、二乙胺水溶液、三乙胺水溶液和氨水中的至少一种；优选地，步骤（3）所述检测的流动相b为二乙胺水溶液；进一步优选地，所述二乙胺水溶液中二乙胺的重量百分数为0.01%-0.10%；更进一步优选地，所述二乙胺水溶液中二乙胺的重量百分数为0.06%。该技术方案在解决了技术问题“目标峰的分离度更好，信号响应更强”的基础上，进一步解决了技术问题“得到的色谱峰更多，峰型更好”。

63、第二项优选方案：步骤（3）所述检测的流速选自0.8-1.2ml/min；优选地，步骤（3）所述检测的流速为0.9 ml/min。该技术方案在解决了技术问题“提高目标峰的分离度，增强信号响应”的基础上，进一步解决了技术问题“提高色谱峰分离度、分离效率以及色谱柱寿命”。

64、第三项优选方案：步骤（3）所述检测的进样体积选自5-25μl；优选地，步骤（3）所述检测的进样体积为10μl。该技术方案在解决了技术问题“提高目标峰的分离度，增强信号响应”的基础上，进一步解决了技术问题“更进一步提高目标峰的分离度，增强信号响应”。

65、第二方面，本发明提供了：所述测定方法在小儿七星茶颗粒的综合质量控制方面的应用。

66、“步骤（2）所用溶剂为体积分数为30%-100%的甲醇”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“水（water）、30%甲醇（30%meoh）、50%甲醇（50%meoh）、70%甲醇（70%meoh）和100%甲醇（100%meoh）5种溶剂体系”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（2）所用溶剂为体积分数为30%-100%的甲醇”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

67、“步骤（3）所述检测的流动相a选自甲醇、乙腈中的至少一种”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“甲醇-水（meoh-water）和乙腈-水（acn-water）”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（3）所述检测的流动相a选自甲醇、乙腈中的至少一种”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于于本发明的保护范围。

68、“所述二乙胺水溶液中二乙胺的重量百分数为0.01%-0.10%”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“乙腈-0.01%二乙胺水（acn-0.01%dea）、乙腈-0.02%二乙胺水（acn-0.02%dea）、乙腈-0.03%二乙胺水（acn-0.03%dea）、乙腈-0.04%二乙胺水（acn-0.04%dea）、乙腈-0.05 %二乙胺水（acn-0.05%dea）、乙腈-0.06%二乙胺水（acn-0.06%dea）”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“所述二乙胺水溶液中二乙胺的重量百分数为0.01%-0.10%”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

69、“步骤（3）所述检测的柱温选自25-35℃”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（3）所述检测的柱温选自25-35℃”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

70、“步骤（3）所述检测的进样体积选自5-25μl”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“不同进样体积（5μl、10μl、15μl、20μl、25μl）”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（3）所述检测的进样体积选自5-25μl”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

71、“步骤（3）所述检测的流速选自0.8-1.2ml/min”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“不同色谱柱流速（0.8 ml/min、0.9 ml/min、1 ml/min、1.1 ml/min、1.2ml/min）”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（3）所述检测的流速选自0.8-1.2ml/min”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

72、本发明的有益效果为：

73、本发明至少具有如下有益效果：

74、（1）本发明的测定方法所得谱图的目标峰的分离度最好，信号响应强；

75、（2）本发明的测定方法检测灵敏度更高；

76、（3）本发明的测定方法精密度高、重复性好、稳定性好、简便高效，为小儿七星茶颗粒的综合质量控制提供可信的借鉴和参考。