一种基于L-肉碱-乳糖酸-水低共熔溶剂的十二种花色苷同步提取测定方法与流程

本发明涉及一种基于l-肉碱-乳糖酸-水低共熔溶剂的十二种花色苷同步提取测定方法，属于食品安全检测。

背景技术：

1、花色苷（anthocyanins）是一类广泛存在于葡萄、蓝莓、桑葚、杨梅、紫甘蓝及多种浆果和谷物中的水溶性色素，属于黄酮类多酚化合物。其不仅是果蔬呈现红色、紫色和蓝紫色等色泽的物质基础，也是评价品种特征、成熟程度、加工品质和贮藏稳定性的重要指标，对食品质量控制具有重要意义。

2、花色苷通常由花色苷元与糖基结合形成，常见花色苷元包括飞燕草素、矢车菊素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、芍药素和锦葵素等。其中，各类花色苷元的3-o-葡萄糖苷和3,5-o-二葡萄糖苷是浆果及其加工制品中较具代表性的花色苷类型。3-o-葡萄糖苷与相应的3,5-o-二葡萄糖苷具有相近的母核结构，但因羟基、甲氧基等取代基类型以及糖基数量和连接位置不同，其分子极性、溶解性、反相色谱保留行为、质谱离子化响应、碰撞诱导裂解特征及化学稳定性均存在差异。通常情况下，3,5-o-二葡萄糖苷因糖基数量较多，亲水性较强，在反相色谱体系中的保留能力相对较弱，其提取效率、离子化响应和稳定性也可能不同于相应的3-o-葡萄糖苷。上述结构和理化性质差异使多种花色苷单体在同一分析体系中实现同步提取、有效分离和准确定量具有一定难度。

3、样品前处理是影响花色苷测定准确性和方法适用性的关键环节。花色苷对ph、温度、光照、溶剂组成和提取时间等条件较为敏感，在提取过程中容易发生降解、转化或损失。同时，鲜果、果汁、果冻、果酱及浆果源保健品等样品在含水量、糖类、有机酸、果胶、蛋白质、多酚、其他色素以及辅料组成等方面差异明显，不同基质对目标物释放、溶剂渗透、提取回收率、色谱分离效果和质谱离子化过程的影响并不一致。特别是3-o-葡萄糖苷和3,5-o-二葡萄糖苷因糖基数量、极性和稳定性不同，在同一前处理体系中的回收行为可能存在差异。现有花色苷检测方法的适用对象主要集中于鲜果、冻干果、果汁或果汁饮料等基质，相较而言，对果酱、果冻、浆果源保健品等深加工或复合基质中多种花色苷同步测定的适用性验证仍不充分。因此，亟须建立一种适用于浆果及其加工制品复杂基质、兼顾多种花色苷提取效率、回收均衡性和定量准确性的前处理及检测方法。

4、目前，花色苷检测常采用紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法以及液相色谱-质谱联用法等。紫外-可见分光光度法多用于总花色苷含量测定，具有操作简便的特点，例如顾怀珊等采用该方法测定红果参品系果实中的花色苷总量，但该方法通常无法对结构相近的花色苷单体进行有效区分。高效液相色谱法可用于特定花色苷单体的分离和定量，例如夏辉等采用高效液相色谱法测定黑米中矢车菊素-3-o-葡萄糖苷含量，其在0.20～50.0μg/ml浓度范围内线性关系良好，相关系数r²为0.999894，检出限和定量限分别为0.1 mg/kg和0.3 mg/kg，但该类方法多针对单一或少数目标成分建立。液相色谱-串联质谱法具有较高的灵敏度和选择性，例如孙侨冶等采用该方法分析鉴定出“秋福”红树莓中的6种花色苷组分，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷含量最高，花色苷含量为4.49 mg/g。由此可见，现有检测方法虽然已应用于部分果实、谷物或浆果样品中花色苷的测定，但其研究对象多为原料型或相对简单基质，针对果酱、果冻、浆果源保健品等深加工或复合基质中多种花色苷单体同步测定的方法适用性和系统验证仍显不足。

5、基于此，本发明旨在解决现有酸化甲醇、酸化乙醇等传统有机溶剂提取体系绿色性不足，对复杂基质中不同糖苷类型花色苷的提取回收率不均衡，花色苷在提取过程中易发生降解，以及现有方法难以在多种浆果及其深加工产品等复杂基质中实现六种3-o-葡萄糖苷类花色苷和六种3,5-o-二葡萄糖苷类花色苷同步提取、有效分离和准确定量的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于l-肉碱-乳糖酸-水低共熔溶剂的十二种花色苷同步提取测定方法，该方法以 l-肉碱、乳糖酸和水构建天然低共熔溶剂作为花色苷提取剂，利用 l-肉碱的季铵型两性离子结构、乳糖酸的多羟基糖酸结构以及适量水形成的酸性氢键网络体系，提高不同糖苷类型花色苷在复杂基质中的同步释放、提取回收率和稳定性，并结合 hplc-ms/ms能够同时实现12种结构相近花色苷的有效分离、同时检测和准确定量；并且方法操作简便、灵敏度高、重复性好、适用基质范围广等优点，可用于浆果及其加工制品中花色苷成分的检测分析和质量控制。

2、为了实现上述目的，提供的技术方案如下：

3、本发明提供了一种基于l-肉碱-乳糖酸-水低共熔溶剂的十二种花色苷同步提取测定方法，所述方法包括如下步骤：

4、（1）样品提取

5、称取样品，加入l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂，混匀后进行涡旋震荡和超声辅助提取；提取结束后离心，取上清液；将上清液采用含甲酸的甲醇水溶液或含甲酸的乙腈水溶液进行稀释，涡旋混匀后再次离心，取上清液经微孔滤膜过滤，得到待测样品提取液；

6、（2）基质标准溶液配制

7、以步骤（1）同样的方法提取的空白基质提取液作为基质溶液，配制一系列浓度的12种花色苷混合标准品的标准溶液；

8、（3）花色苷含量测定

9、将步骤（2）制备的系列浓度花色苷混合标准溶液和步骤（1）制备的待测样品提取液，采用 hplc-ms/ms 进行检测；以各目标花色苷的浓度为横坐标，以对应色谱峰面积或峰面积比为纵坐标，建立标准曲线；根据待测样品提取液中各目标物的响应值，计算样品中十二种花色苷的含量。

10、在一种实施方式中，所述十二种花色苷包括飞燕草素-3-o-葡萄糖苷、矢车菊素-3-o-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-o-葡萄糖苷、天竺葵素-3-o-葡萄糖苷、芍药素-3-o-葡萄糖苷、锦葵素-3-o-葡萄糖苷、飞燕草素-3,5-o-二葡萄糖苷、矢车菊素-3,5-o-二葡萄糖苷、矮牵牛素-3,5-o-二葡萄糖苷、天竺葵素-3,5-o-二葡萄糖苷、芍药素-3,5-o-二葡萄糖苷和锦葵素-3,5-o-二葡萄糖苷。

11、在一种实施方式中，步骤（1）所述l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂的配制为：将l-肉碱、乳糖酸和水按比例混合，加热搅拌至形成透明均一液体，冷却后得到 l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂。

12、在一种实施方式中，所述l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂中，l-肉碱与乳糖酸的摩尔比为 1:(0.2~3.0)，优选为 1:(0.5~2.0)，更优选为 1:(0.8~1.5)。

13、在一种实施方式中，所述l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂中水的含量为 l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂总质量的 15~65 wt%，优选为 25~50 wt%，更优选为 30~45wt%。

14、在一种实施方式中，步骤（1）所述l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂的 ph 为1.5~4.0，优选为 2.0~3.2，更优选为 2.3~2.8。

15、在一种实施方式中，所述加热搅拌温度为 30~90℃，优选为 40~70℃；搅拌时间为10~120 min，优选为 20~60 min。

16、在一种实施方式中，步骤（1）所述样品与l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂的质量体积比为 1:(5~60) g/ml，优选为 1:(10~40) g/ml，更优选为 1:(15~25) g/ml。

17、在一种实施方式中，步骤（1）所述涡旋震荡条件为 1000~2000 r/min，2~6 min，优选为 1000~1500 r/min，3~5 min。

18、在一种实施方式中，步骤（1）所述超声辅助提取的温度为 20~55℃，优选为 30~45℃；超声辅助提取时间为 5~60 min，优选为 20~40 min；超声频率为 40 khz。

19、在一种实施方式中，步骤（1）所述离心条件为 4000~5500 r/min，10~25 min，4℃；所述再次离心条件为 9000~11000 r/min，2~8 min，4℃。

20、在一种实施方式中，步骤（1）所述稀释所用溶液为甲醇-水-甲酸体系或乙腈-水-甲酸体系；其中，甲醇或乙腈的体积分数为 30~70%，优选为 45~55%；甲酸体积分数为 0.5~3.0%，优选为 1.0%。

21、在一种实施方式中，步骤（3）所述 hplc-ms/ms 检测时的液相色谱条件为：色谱柱：acquity-uplc-beh-c18（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），柱温35~45℃；流速：0.3~ 1.5ml/min；流动相：a为甲酸水溶液，b为乙腈；梯度洗脱，进样量：2~5 μl。

22、在一种实施方式中，所述流动相 a 中甲酸的体积分数为 0.5~2.0%，优选为1.0%。

23、在一种实施方式中，所述分段线性梯度洗脱的程序为：0-2min，5%乙腈相，2-10min，5%-30%乙腈相，10-15min，30%-80%乙腈相，15-18min，80%乙腈相，18-18.5min，80%-5%乙腈相，18.5-20min，5%乙腈相。

24、在一种实施方式中，步骤（3）所述质谱条件为：采用电喷雾离子源，正离子检测模式，多反应监测模式进行定性和定量分析。

25、在一种实施方式中，步骤（3）所述hplc-ms/ms测定时质谱条件为：采用电喷雾离子源，正离子检测模式，多反应监测模式；气帘气 cur 为20~30 psi，碰撞气 cad 为medium，离子喷雾电压 is 为5400~5600 v，离子源温度 tem 为450~550℃，离子源气1 gs1 为55~65 psi，离子源气2 gs2 为35~45 psi。

26、本发明的另一目的是提供上述方法在浆果及其加工制品中花色苷组成分析、品质评价或检测方法建立中的应用。

27、有益效果：

28、本发明建立了一种基于 l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂的十二种花色苷同步提取及 hplc-ms/ms 测定方法。与现有技术中多集中于总花色苷含量、少数代表性花色苷单体或特定基质样品的检测方法相比，本发明能够同时覆盖六种3-o-葡萄糖苷和六种3,5-o-二葡萄糖苷类花色苷，目标物种类更加全面，可实现多种结构相近花色苷的同时检测和定量；具体优势如下：

29、（1）本发明采用 l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂作为花色苷提取剂，区别于传统酸化甲醇、酸化乙醇等有机溶剂提取体系，所述天然低共熔溶剂中，l-肉碱具有季铵型两性离子结构，乳糖酸具有多羟基糖酸结构，二者与适量水共同形成具有强极性、酸性微环境和多重氢键作用的溶剂体系。该体系能够增强对花色苷糖苷结构的溶剂化作用，促进复杂基质中花色苷释放，并有利于维持花色苷在提取过程中的稳定状态；

30、（2）本发明针对六种 3-o-葡萄糖苷类花色苷和六种 3,5-o-二葡萄糖苷类花色苷在极性、溶解性、稳定性及提取回收行为方面存在差异的特点，通过优化 l-肉碱与乳糖酸的摩尔比、水含量、样品与天然低共熔溶剂的质量体积比、提取温度、提取时间和超声辅助条件，使不同结构类型的花色苷均能够获得较好的提取效果。该方法避免了现有方法仅以总花色苷提取量或单一高含量组分为优化指标时，可能导致低含量组分、敏感组分或不同糖苷类型花色苷回收率不均衡的问题，有利于提高十二种目标花色苷同步测定的准确性和可靠性；

31、（3）本发明将 l-肉碱-乳糖酸-水天然低共熔溶剂提取与 hplc-ms/ms 定量检测相结合，并通过稀释、离心和过滤步骤改善天然低共熔溶剂提取液与液相色谱-串联质谱系统的兼容性。该方法在保持前处理流程简便、提取时间较短和操作便捷的同时，可减少传统酸化有机溶剂在提取步骤中的使用，适用于批量样品检测。

32、（4）经方法学验证，本发明所述方法具有良好的基质适应性、提取回收率、过程效率、精密度和准确度，能够适用于鲜果、果汁、果酱、果冻及浆果源保健品等多种浆果基质及其加工制品中十二种花色苷的同步测定，可为浆果及其加工制品的花色苷组成分析、质量评价和质量控制提供可靠的技术手段。