一种流式荧光法检测试剂盒及其检测方法

本发明涉及生物与新医药的，具体而言，涉及一种流式荧光法检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、过敏性炎症包含过敏性哮喘与特应性皮炎，是高发慢性炎症疾病，共同形成特应性进程。全球哮喘患病率 3%~5%，特应性皮炎患病率超 10%，发病与环境污染物暴露高度相关。二者发病机制存在免疫失衡特征：过敏性哮喘由il-4、il-5、il-13等th2（t辅助细胞2型）细胞因子介导，引发嗜酸性粒细胞浸润与气道高反应；特应性皮炎为 th2/th22 （t辅助细胞2型/t辅助细胞22型）混合型炎症，在 tslp、il-22介导下破坏皮肤屏障，il-31则诱发剧烈瘙痒，且亚洲人群还呈现独特的 th17/th2（t辅助细胞17型/t辅助细胞2型） 混合型炎症特点。当前 luminex xmap液相芯片等流式荧光多重细胞因子检测，是解析其免疫网络的主流手段。

2、目前临床与科研多采用流式荧光微球法多重细胞因子检测试剂盒，主流为进口bio-rad 等 luminex平台产品，配备 th1/th2/th17 经典因子检测面板，可单样本多指标并行检测，已成为系统性炎症评估的常用工具。

3、但是，相关技术中却存在以下至少一个问题：现有检测试剂盒多适配单一疾病，无法体现疾病异质性；现有检测试剂盒仅适配血清，未优化验证肺泡灌洗液、皮肤组织液的局部炎症样本，难以区分全身与局部炎症；现有检测试剂盒的关键指标缺失无法区分经典th2炎症与亚洲人群th17/th2混合型炎症，不利于生物制剂精准用药。

技术实现思路

1、本发明解决了以下至少一个问题：现有检测试剂盒多适配单一疾病，无法体现疾病异质性；现有检测试剂盒仅适配血清，未优化验证肺泡灌洗液、皮肤组织液的局部炎症样本，难以区分全身与局部炎症；现有检测试剂盒的关键指标缺失无法区分经典th2炎症与亚洲人群th17/th2混合型炎症，不利于生物制剂精准用药。

2、为解决上述问题，第一方面，本发明提供一种流式荧光法检测试剂盒，流式荧光法检测试剂盒用于检测过敏性炎症多细胞因子，流式荧光法检测试剂盒包括：

3、编码捕获微球工作液、生物素化抗体工作液、sa-pe工作液、保存液、冻干定标品、定标品稀释液以及磁珠清洗液；

4、编码捕获微球工作液由12种捕获抗体分别包被了的羧基编码磁性微球与保存液混合而成；

5、12种捕获抗体分别对应的12种过敏性炎症细胞因子包括：il-4、il-13、il-31、il-22、il-25、il-33、il-17a、il-23、il-10、tnf-α、ifn-γ、tslp；

6、生物素化抗体工作液包含分别针对12种过敏性炎症细胞因子的生物素化检测抗体；

7、sa-pe工作液包含链霉亲和素与藻红蛋白的偶联物。

8、在本发明的一个实例中，保存液包括：

9、含有bsa、tween-20和proclin 300的pbs缓冲液；

10、其中，pbs缓冲液的浓度为10mm，ph值为7.4。

11、在本发明的一个实例中，冻干定标品由含有12种重组细胞因子蛋白的定标品原液经分装冻干而成，且定标品原液中各重组蛋白的浓度为0.5μg/ml。

12、在本发明的一个实例中，编码捕获微球工作液的制备方法包括：

13、使用mes缓冲液对羧基编码磁性微球进行第一清洗处理；

14、完成第一清洗处理后，向羧基编码磁性微球中加入edc溶液和sulfo-nhs溶液，进行活化反应；

15、待活化反应结束后，使用naac缓冲液对活化后的羧基编码磁性微球进行第二清洗处理；

16、完成第二清洗处理后，将捕获抗体加入活化后的羧基编码磁性微球中，并加入naac缓冲液进行定容、混匀后进行偶联反应，使得捕获抗体定向共价偶联于羧基编码磁性微球的表面形成抗体包被微球；

17、待偶联反应结束后，使用含bsa的tris缓冲液进行封闭洗涤3-4次。

18、在本发明的一个实例中，活化反应的反应时长为30分钟-40分钟，反应温度为25℃-30℃；

19、和/或偶联反应的反应时长为3小时-4小时，反应温度为25℃-30℃；

20、和/或mes缓冲液的浓度为50mm，ph值为4.75。

21、在本发明的一个实例中，12种编码捕获微球工作液的配制比例为：每种抗体包被微球各取0.5ml混合，加入4.0ml保存液，补充保存液定容至10.0ml。

22、在本发明的一个实例中，生物素化抗体工作液的配制方法为：将12种生物素化检测抗体各取10μl混合，加入9.88ml保存液，定容至10.0ml。

23、在本发明的一个实例中，sa-pe工作液的配制方法为：取sa-pe原液10μl，加入9.99ml保存液，定容至10.0ml。

24、在本发明的一个实例中，将12种重组蛋白原液（各0.5μg/ml）各取0.5ml混合，加入19.0ml保存液，定容至25.0ml，得到定标品原液；

25、将定标品原液按每瓶0.5ml分装于西林瓶中，经冻干机冻干，制得冻干定标品；

26、其中，12种重组蛋白原液的浓度为0.5μg/ml。

27、第二方面，本发明还提供一种使用如上述任一实例中的流式荧光法检测试剂盒的检测方法，检测方法包括：

28、校准品梯度稀释：将冻干定标品用分析缓冲液ⅰ复溶，室温放置15分钟充分溶解，作为最高浓度校准液s7；

29、取校准液s7采用1:2.5梯度稀释法，制备s6、s5、s4、s3、s2、s1和s0共7个浓度梯度的校准液；

30、孵育反应：向反应容器中加入50μl校准液或待测样本，再加入50μl捕获微球悬液，避光室温混匀孵育1小时-2小时；

31、加入检测抗体：磁分离去除上清液，加入100μl生物素化抗体工作液，避光室温混匀孵育1小时；

32、加入sa-pe：磁分离去除上清液，用200μl磁珠清洗液洗涤一次，加入100μl sa-pe工作液，避光室温混匀孵育0.5小时；

33、检测分析：磁分离去除上清液，用200μl磁珠清洗液重悬微球，采用流式细胞仪检测各羧基编码磁性微球的pe荧光强度mfi；

34、浓度计算：以校准品浓度为横坐标、mfi值为纵坐标，采用5参数逻辑回归5pl拟合软件绘制标准曲线，根据样本的mfi值计算其对应浓度。

35、采用本发明的技术方案后，能够达到如下技术效果：

36、（1）本发明提供的一种流式荧光法检测试剂盒通过集成12种过敏性炎症特征细胞因子检测，可覆盖不同过敏性炎症亚型及人群差异特征，充分体现了疾病异质性，适用范围更广、临床适配性更强，突破了现有检测试剂盒仅适配单一疾病的局限；

37、（2）本发明提供的一种流式荧光法检测试剂盒，通过对组分体系进行配方优化，不仅适用于常规血清样本，还可兼容肺泡灌洗液、皮肤组织液局部炎症样本的检测验证，能够有效区分全身炎症与皮肤局部炎症状态，避免了现有检测试剂盒样本适用类型单一的缺陷，满足了多临床样本检测需求；

38、（3）本发明提供的一种流式荧光法检测试剂盒所筛选的12种捕获抗体分别对应的12种过敏性炎症细胞因子同时覆盖了th2炎症标志物、th17通路及混合型炎症特征指标，可区分经典 th2 炎症与亚洲人群特有的th17/th2混合型炎症亚型，避免了现有检测试剂盒关键检测指标缺失的情况；

39、（4）本发明提供的一种流式荧光法检测试剂盒通过采用流式荧光检测技术搭配羧基编码磁性微球多重检测体系，结合冻干定标品、定标品稀释液、分析缓冲液ⅰ以及磁珠清洗液成套试剂配置，检测灵敏度高、重复性好、定量结果精准，更适配临床批量样本及科研机制研究场景。