一种用于检测猪流行性腹泻病毒sIgA的ELISA检测试剂盒及制备方法与流程

本发明涉及猪流行性腹泻病毒siga检测，具体为一种用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒及制备方法。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)引起的一种急性、传染性强的腹泻疾病。发病猪常出现腹泻、呕吐、食欲不振、消瘦等临床表现。自发现以来该病的流行区域仍不断扩大，已发展为严重危害养猪业的流行传染病之一，给全球的养猪业造成巨大经济损失。

2、pedv的保护性免疫以肠道黏膜局部免疫为主，肠道黏膜分泌型siga是抵御该病毒入侵、阻断肠道感染及评价疫苗保护效力的核心特异性抗体，因此，相较于血清抗体，肛拭子和肠冲洗液等黏膜样本中的siga可真实反映肠道免疫应答，也是临床与科研中评估pedv免疫效果的金标准标志物。

3、然而，临床检测黏膜中的siga时，会面临多重困境：首先，黏膜样本基质复杂，含大量黏蛋白、降解多肽和粪便杂质，导致非特异性背景干扰极强；其次，检测时，黏膜中依赖构象表位的siga需要与体外重组表达的s1三聚体抗原蛋白结合，检测过程高度依赖s1三聚体的完整构象，然而该s1三聚体抗原蛋白的构象不稳定，易发生亚基解离形成单体，现有的elisa检测试剂盒依赖长时间包被来提升抗原载量，然而该方法会进一步加剧s1三聚体抗原蛋白解离为单体，丧失黏膜中依赖构象表位的siga的特异性识别，最终导致检测信号显著降低、出现假阴性结果。

4、因此临床检测时，多以检测血清iga为主。然而临床中却经常出现血清iga检测为阳性，但猪场依旧爆发猪流行性腹泻，原因为虽然血清iga检测为阳性，但肠道黏膜中依赖构象表位的siga不足，而依赖构象表位的siga才能对抵抗猪流行性腹泻病毒起到主要作用。

5、因此，目前亟需一种包被时间短、可保护s1三聚体抗原蛋白空间构象的用于检测猪流行性腹泻病毒黏膜siga的elisa检测试剂盒。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒及制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒，试剂盒包括包被有s1-trimer三聚体抗原蛋白的聚苯乙烯酶标板，所述s1-trimer三聚体抗原蛋白上连接有his标签，所述聚苯乙烯酶标板上共价修饰有ni-nta，s1-trimer三聚体抗原蛋白上的his标签与ni-nta的镍离子配位结合。

3、进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、酶标记物溶液、阴阳性对照、洗涤液、显色液、终止液。

4、用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒中的包被有s1-trimer三聚体抗原蛋白的聚苯乙烯酶标板的制备步骤包括：

5、（1）制备ni-nta共价修饰聚苯乙烯酶标板：

6、将聚苯乙烯酶标板的孔内加入硫酸-高锰酸钾水溶液，室温避光反应，反应完成后洗涤沥干；加入edc/sulfo-nhs活化液，室温避光反应后弃液；加入氨基-nta偶联液，密封后置于摇床上振荡反应，弃液后pbst洗涤；加入乙醇胺封闭液，室温静置反应，弃液后pbst洗涤；加入六水合氯化镍螯合工作液，室温静置反应，弃液后用pbst和超纯水洗涤，干燥后得到ni-nta共价修饰聚苯乙烯酶标板；

7、（2）s1-trimer三聚体抗原蛋白包被：

8、取ph 9.2的cbs缓冲液，加入s1-trimer三聚体抗原蛋白至终浓度2μg/ml，在搅拌条件下，缓慢滴加dss溶液至质量体积终浓度为0.05%，然后缓慢滴加mpeg-g-pll溶液至质量体积终浓度为0.03%，混匀后得到抗原包被液；

9、向步骤（1）中得到的ni-nta共价修饰聚苯乙烯酶标的孔内加入抗原包被液，置于恒温培养箱中25℃静置孵育30min，弃液后pbst洗涤，加入含有bsa和泊洛沙姆188的pbst溶液，37℃封闭60min，弃液后pbst洗涤，干燥后得到s1-trimer三聚体抗原蛋白包被的ni-nta共价修饰聚苯乙烯酶标板。

10、进一步的，

11、所述步骤（1）中的edc/sulfo-nhs活化液为：向ph 5.2，0.1m mes缓冲液中加入edc和sulfo-nhs，使edc终浓度为20mm、sulfo-nhs终浓度为10mm。

12、进一步的，

13、所述步骤（1）中的硫酸-高锰酸钾水溶液的浓度为0.5 mol/l；氨基-nta偶联液的浓度为2mg/ml，氨基-nta偶联液使用ph 8.3，0.1m nahco3溶液作为溶剂。

14、进一步的，

15、所述步骤（1）中的乙醇胺封闭液的浓度为1mol/l，ph为8.5；所述六水合氯化镍螯合工作液的浓度为50mm。

16、进一步的，所述步骤（2）中的mpeg-g-pll溶液的质量体积浓度为1.0%。

17、进一步的，所述步骤（2）中的dss溶液的质量体积浓度为1.0%，溶剂为dmso。

18、进一步的，所述步骤（2）中的含有bsa和泊洛沙姆188的pbst溶液中，bsa的质量体积浓度为1.0%，泊洛沙姆188的质量体积浓度为0.1%。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、本申请通过ni-nta、mpeg-g-pll与dss的协同作用，使s1-trimer三聚体抗原蛋白在酶标板包被时维持空间构象的稳定，提高与依赖pedv-s蛋白构象表位的siga的特异性识别效率及包被效率。dss通过分子内亚基交联，可以在短时间内抑制s1-trimer三聚体抗原蛋白解聚，保护抗原完整构象；mpeg-g-pll带强正电，聚苯乙烯酶标板表面带负电，mpeg-g-pll通过与抗原的静电作用，能够快速输送抗原至酶标板表面，mpeg-g-pll与dss的组合使用，能够保证dss对抗原构象的保护失效前，将抗原输送至酶标板表面；当抗原靠近酶标板表面时，抗原上的his标签与酶标板上的镍离子结合，实现快速锚定。本申请相较于传统酶标板的抗原过夜包被，能够缩短包被时间，保护抗原空间构象，提高siga检测的效率。

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括包被有s1-trimer三聚体抗原蛋白的聚苯乙烯酶标板，所述s1-trimer三聚体抗原蛋白上连接有his标签，所述聚苯乙烯酶标板上共价修饰有ni-nta，s1-trimer三聚体抗原蛋白上的his标签与ni-nta的镍离子配位结合；包被所述s1-trimer三聚体抗原蛋白时，采用mpeg-g-pll和dss溶液进行处理以促进包被。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液、酶标记物溶液、阴阳性对照、洗涤液、显色液和终止液。

3.根据权利要求1-2任一项所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒中的包被有s1-trimer三聚体抗原蛋白的聚苯乙烯酶标板的制备步骤包括：

4.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

5.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

6.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

7.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的mpeg-g-pll溶液的质量体积浓度为1.0%。

8.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的dss溶液的质量体积浓度为1.0%，溶剂为dmso。

9.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒siga的elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的含有bsa和泊洛沙姆188的pbst溶液中，bsa的质量体积浓度为1.0%，泊洛沙姆188的质量体积浓度为0.1%。