一种侧流试纸条及其C线稳定性的改进方法和检测试剂盒

本发明涉及检测试纸条领域，尤其涉及一种侧流试纸条及其c线稳定性的改进方法和检测试剂盒。

背景技术：

1、规律间隔短回文重复序列（crispr）与crispr相关蛋白（cas）组成的系统，是细菌和古菌适应性免疫系统的重要组成部分。在向导rna的引导下，cas蛋白能够特异性识别并切割目标dna或rna。此外，cas12、cas13及cas14等蛋白还表现出非特异性切割周围dna或rna的活性，该特性已被广泛应用于核酸检测。传统的crispr/cas检测方法通常利用cas蛋白剪切荧光-淬灭基团标记的报告探针，通过检测体系中的荧光信号来读取结果。然而，该方法依赖酶标仪、荧光显微镜等昂贵设备，限制了其在资源有限场景下的推广应用。

2、与荧光检测方式相比，侧流试纸条（lateral flow strip, lfs）在即时检测（point of care testing, poct）应用中具有实用优势。侧流试纸条通常由样品垫、结合垫、硝酸纤维素（nitrocellulose, nc）膜和吸水纸依次交叠于聚氯乙烯（polyvinylchloride, pvc）衬底上构成。待测样品在侧向流动过程中，先后与结合垫及nc膜上的生物活性材料（如抗体、抗原或生物大分子）发生特异性反应，进而在nc膜上形成检测线（testline, t line）和质控线（control line, c line）信号，可通过肉眼直接判读或借助简易仪器检测。因此，相比于荧光检测，侧流试纸条检测具有便捷性和成本优势，使得crispr/cas检测能够适用于poct场景。

3、侧流试纸条的有效性易受保存条件、试剂活性、样本体积及流动顺畅性等多种因素制约。在实际应用中，尤其是由非专业人员使用时，侧流试纸条失效或操作不当均可导致检测结果的误判。为此，侧流试纸条在设计中引入了c线作为内置的质量控制机制，通过在c线固定抗种属抗体以特异性捕获标记抗体来实现显色，从而真实反映检测系统的有效性。无论样本中是否存在待测靶标，只要侧流试纸条和试剂功能正常，c线均应显色，若c线未显色，则表明检测过程存在异常，所获结果应视为无效。因此，c线是保障侧流试纸条检测结果有效性的必要组成部分，也是其作为标准化poct产品的核心质控要素。

4、目前，用于crispr/cas检测的侧流试纸条已实现商业化，其判读方式基本以正向信号为主。然而，这类侧流试纸条在实际应用中普遍存在c线失效的问题。jonathan sgootenberg等开发的sherlock平台在检测寨卡病毒时，c线的信号强度随靶标核酸浓度升高而逐渐减弱。james p. broughton等利用其开发的detectr平台检测sars-cov-2病毒核酸的n基因和e基因时，阳性样本对应的侧流试纸条c线出现了信号消失的现象。han chen等利用侧流试纸条检测不同质粒浓度下的crispr/cas12a产物时，当质粒浓度升高至2.1 ×10³ copies/μl时，c线信号显著减弱，当质粒浓度升至2.1 × 106copies/μl时，c线信号完全消失。上述c线失效的现象归因于该类侧流试纸条的质控信号依赖于完整报告探针的存在，当待测靶标浓度过高导致cas蛋白切割活性处于饱和状态时，体系中几乎不存在完整的报告探针，c线便完全无法显色。

5、此类侧流试纸条的c线信号不稳定问题，削弱了其作为质量控制的功能，给检测结果的可靠性判读带来阻碍。当c线信号消失时，无法区分该现象是由于样本中高浓度核酸导致报告探针耗尽引起，还是侧流试纸条本身失效所致。这一不确定性限制了用于crispr/cas检测的侧流试纸条在实际检测中的推广应用，尤其是在高浓度样本检测场景中。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种侧流试纸条的c线稳定性改进方法，其将标记鼠抗fitc抗体的红色乳胶微球布施于结合垫，同时将链霉亲和素和羊抗鼠igg分别包被于c线和t线，样品垫、结合垫、反应膜及吸水垫依次交叠于衬底上组装成侧流试纸条，通过在样品稀释液中加入两端分别标记fitc和生物素的双链dna，又通过链霉亲和素、双链dna以及鼠抗fitc抗体形成复合物，从而维持c线信号。

2、本发明还提出一种c线稳定的侧流试纸条，其由上述的c线稳定性改进方法制备而成。

3、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种侧流试纸条的c线稳定性改进方法，包括以下步骤：

5、（1）将生物缓冲液、电解质、白蛋白、cas蛋白、crrna和报告探针混匀配制成反应基础体系，加入靶序列样品，恒温孵育反应，获得crispr/cas反应产物；

6、（2）往无核酸酶超纯水中加入合成的双链dna，制得样品稀释液；

7、（3）将样品垫、结合垫、反应膜和吸水纸依次交叠在衬底上以组装成侧流试纸条，将侧流试纸条裁组装在塑料卡壳中；结合垫布施标记鼠抗fitc抗体的红色乳胶微球；反应膜包被的链霉亲和素形成t线；反应膜包被的羊抗鼠igg溶液形成c线；

8、（4）采用配制的样品稀释液对crispr/cas反应产物进行稀释处理；吸取稀释后的反应产物，上样滴加至侧流试纸条的样品垫区域，完成侧流试纸条的c线改进。

9、可优化地，在步骤（3）中，结合垫的制备方法为：将乳胶微球与mes缓冲液混合，加入edc和nhs进行活化反应；活化反应结束后，离心去除上清液，将沉淀的活化微球重新分散于mes缓冲液中；向活化微球中加入鼠抗fitc抗体，室温进行标记反应；向标记反应体系中加入bsa封闭液，封闭微球表面未反应的活性位点；封闭反应结束后，离心去除上清液，将微球沉淀重新分散于微球保存缓冲液中；将标记有鼠抗fitc抗体的乳胶微球喷涂于结合垫上，干燥后即得。

10、可优化地，在步骤（3）中，微球保存缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液含有蔗糖、海藻糖、bsa、酪蛋白钠和防腐剂。

11、可优化地，在步骤（3）中，反应膜的制备方法为：将nc膜粘贴于pvc底板上；在nc膜上包被链霉亲和素，形成t线；在nc膜上包被羊抗鼠igg，形成c线；包被完成后干燥处理。

12、可优化地，在步骤（3）中，样品垫的制备方法为：将样品垫处理液均匀涂布于玻璃纤维素膜上，经干燥处理即得；所述样品垫处理液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含有蔗糖、bsa、peg-4000、表面活性剂和防腐剂。

13、可优化地，在步骤（1）中，将三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、无机盐、重组白蛋白、lbacas12a蛋白、crrna及报告探针混匀，加入靶标双链dna样品，恒温孵育反应，获得crispr/cas12a反应产物。

14、可优化地，在步骤（1）中，将4 - 羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、无机盐、牛血清白蛋白、还原剂、lwacas13a蛋白、crrna及报告探针混匀，加入靶标rna样品，恒温孵育反应，获得crispr/cas13a反应产物。

15、一种c线稳定的侧流试纸条，由上述的一种侧流试纸条的c线稳定性改进方法制备而成。

16、一种检测试剂盒，包括上述的一种c线稳定的侧流试纸条。

17、与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有以下有益效果：

18、本方案提供一种侧流试纸条的c线稳定性改进方法，其将标记鼠抗fitc抗体的红色乳胶微球喷涂于结合垫，同时将链霉亲和素和羊抗鼠igg分别包被于c线和t线，样品垫、结合垫、反应膜及吸水垫依次交叠于衬底上组装成侧流试纸条，通过在样品稀释液中加入两端分别标记fitc和生物素的双链dna，又通过链霉亲和素、双链dna以及鼠抗fitc抗体形成复合物，从而维持c线信号，解决了侧流试纸条的c线信号不稳定所导致质量控制的功能受限的问题。