一种原花青素衍生碳点及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种原花青素衍生碳点及其制备方法和应用。

背景技术：

1、神经退行性疾病是一类以神经元进行性丢失和功能障碍为特征的神经系统疾病，其中帕金森病及路易体痴呆等突触核蛋白病以α-突触核蛋白异常纤维化为核心病理特征。α-突触核蛋白的异常聚集形成不溶性的淀粉样纤维，沉积于神经元内，导致细胞毒性、氧化应激和线粒体功能障碍，最终驱动神经元死亡。因此，针对α-突触核蛋白纤维这一核心病理靶点开发有效的治疗策略，是神经退行性疾病治疗领域的重要研究方向。

2、目前，针对α-突触核蛋白纤维的干预策略主要包括以下几类：

3、第一类是小分子抑制剂，例如尼洛替尼。这类化合物通过抑制α-突触核蛋白的聚集或促进其清除发挥作用。然而，小分子药物普遍存在靶向性差的问题，难以特异性区分病理性的纤维态α-突触核蛋白与正常的单体态α-突触核蛋白，容易干扰正常的生理功能。此外，小分子的脑部渗透率低，难以在病变部位达到有效浓度，且存在潜在的全身毒性。

4、第二类是抗体疗法。抗体能够特异性识别并结合α-突触核蛋白，但抗体疗法成本高昂，且由于抗体分子量大，难以穿越血脑屏障进入中枢神经系统。更重要的是，抗体主要作用于胞外蛋白，对已形成的细胞内纤维清除能力有限，无法有效干预细胞内的病理过程。

5、第三类是基于金属纳米粒子或聚合物纳米材料的策略。纳米材料利用其尺寸效应和表面可修饰性，可在一定程度上实现对α-突触核蛋白纤维的干预。然而，许多合成纳米材料面临生物相容性不佳的问题，其长期毒性尚不明确，难以满足中枢神经系统长期用药的安全要求。此外，现有纳米材料的功能较为单一，多数仅具有抑制聚集或仅具有促进清除的单一功能，难以同时实现对已形成纤维的降解和对新纤维生成的抑制。

6、上述现有技术缺陷长期未能解决，其根本难度在于以下三个方面：第一，α-突触核蛋白聚集机制复杂，涉及从可溶性单体到寡聚体再到成熟纤维的多阶段构象转变，需在精准干预病理过程的同时避免干扰其正常生理功能；第二，开发能高效穿透血脑屏障并特异性靶向病变神经元的递送系统极具挑战，需要兼顾尺寸效应、表面化学和靶向能力的协同设计；第三，兼具高效降解纤维、低毒性和良好生物可降解性的材料设计属于多学科交叉的难题，传统合成材料难以同时满足上述要求。

7、因此，亟需开发一种兼具高效降解已形成α-突触核蛋白纤维、抑制新纤维生成、良好生物相容性、低毒性以及跨血脑屏障递送能力的多功能纳米材料。

技术实现思路

1、本技术提供一种原花青素衍生碳点及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中神经退行性疾病治疗领域存在的靶向性差、脑部渗透率低、生物相容性不佳以及功能单一等问题。

2、为了解决上述问题，本技术采用的技术方案如下：

3、第一方面，本技术提出了一种原花青素衍生碳点，所述衍生碳点以原花青素为碳源，通过水热法制备得到，所述衍生碳点为球形纳米颗粒，平均直径为1-2nm，形貌高度为5-15nm，晶格间距为0.30-0.38nm，且其表面含有羧基和酚羟基官能团，并具有π-π共轭结构。

4、进一步地，所述衍生碳点由c、o元素组成，c含量为60-80%、o含量为15-30%。

5、进一步地，所述衍生碳点表面含有c=o键、c-h键和c-o键。

6、进一步地，所述羧基和酚羟基源自所述原花青素前体的官能团保留。

7、进一步地，所述衍生碳点具有光致发光特性。

8、进一步地，所述衍生碳点表面具有可修饰性。

9、进一步地，所述碳点内部具有石墨化结构的碳核。

10、进一步地，所述碳点由原花青素经180-250℃热解碳化形成，所述原花青素前体的官能团经热解后保留于碳点表面。

11、第二方面，本技术提出了一种第一方面所述原花青素衍生碳点的制备方法，包括：步骤1：将原花青素溶于无水乙醇和超纯水的混合溶剂中，超声分散；步骤2：将超声后溶液转移至高压反应釜中，180-250℃加热6-16h；步骤3：将反应后溶液冷却后过滤，收集滤液，去除不溶性残留物；透析纯化，冻干，低温保存。

12、进一步地，步骤1中，所述原花青素与混合溶剂的用量比为1：50-200，所述无水乙醇与超纯水的体积比为1：2-4。

13、进一步地，所述超声分散时间为15-60min。

14、进一步地，步骤2中，所述高压反应釜为内衬特氟龙的高压反应釜。

15、进一步地，步骤3中，所述过滤采用0.10-0.45μm微滤膜。

16、进一步地，所述透析纯化采用截留分子量为500-2000da的透析膜，透析时间为4-16h，每1-4h更换一次超纯水。

17、进一步地，所述低温保存温度为-80-4℃。

18、第一方面所述的原花青素衍生碳点或第二方面所述方法制备的原花青素衍生碳点在制备用于干预α-突触核蛋白纤维化过程的制剂中的用途。

19、进一步地，所述制剂用于治疗突触核蛋白病，所述突触核蛋白病为帕金森病或路易体痴呆。

20、进一步地，所述制剂作为研究蛋白质纤维化机制或筛选抑制剂的科研工具。

21、进一步地，所述原花青素衍生碳点以0.5-2mg/ml的浓度与0.5-2mg/ml的α-突触核蛋白预制纤维在pbs缓冲液中于35-40℃、500-1500rpm条件下共同孵育1-14天；所述pbs缓冲液ph为7.0-7.6。

22、进一步地，所述原花青素衍生碳点以0.01-0.05mg/ml的浓度应用于由10-50μmα-突触核蛋白预制纤维诱导的sh-sy5y细胞模型，且以预处理方式给药。

23、进一步地，所述制剂还用于基于所述碳点光致发光特性的诊断成像。

24、进一步地，所述制剂通过跨血脑屏障递送并靶向细胞内α-突触核蛋白纤维。

25、进一步地，所述原花青素衍生碳点在体外血脑屏障模型中的跨膜转运效率在60-90分钟内达到90%以上；所述制剂还用于下调细胞内α-突触核蛋白在ser129位点的病理磷酸化水平；所述原花青素衍生碳点通过降解细胞内病理性α-突触核蛋白聚集体，减少激酶识别的磷酸化底物或改变蛋白构象，从而降低病理磷酸化负荷。

26、一种在细胞模型中评估原花青素衍生碳点对α-突触核蛋白病理聚集干预效果的方法，包括以下步骤：步骤1：使用α-突触核蛋白预制纤维处理sh-sy5y细胞建立病理聚集模型；步骤2：将原花青素衍生碳点与α-突触核蛋白预制纤维共处理所述细胞；步骤3：通过western blot检测细胞内α-突触核蛋白单体、寡聚体、聚集体及磷酸化α-突触核蛋白的表达水平；步骤4：通过免疫荧光染色检测细胞内磷酸化α-突触核蛋白阳性包涵体的分布和荧光强度；步骤5：定量分析原花青素衍生碳点对α-突触核蛋白病理聚集和磷酸化的抑制效果。

27、一种评估原花青素衍生碳点穿越血脑屏障能力的方法，包括以下步骤：步骤1：在transwell小室的上室培养bend.3细胞形成紧密连接单层；步骤2：在下室接种sh-sy5y细胞；步骤3：在上室加入原花青素衍生碳点或原花青素单体，通过检测跨膜电阻确认单层完整性；步骤4：在不同时间点测定下室中原花青素衍生碳点或原花青素单体的转运效率；步骤5：比较原花青素衍生碳点与原花青素单体的跨膜转运差异。

28、本技术提出的一个或多个技术方案，至少具有以下技术效果：

29、（一）原花青素本身具有良好的生物相容性和抗炎活性，但缺乏跨血脑屏障的递送能力和对蛋白纤维的靶向作用。碳点具有纳米尺寸效应和表面可修饰性，但传统碳点表面缺乏与蛋白质特异性结合的化学基团。本技术将二者在原子/分子层面进行结构耦合：原花青素经热解碳化后，其芳香骨架重组为碳点的石墨化碳核，赋予碳点光致发光特性；其边缘的羧基和酚羟基保留于碳点表面，赋予碳点生物识别活性。这种核-壳式的结构协同使碳点同时具备了能到达靶点（纳米尺寸跨血脑屏障）和能识别靶点（官能团特异性结合纤维）的双重能力，二者缺一不可，单独的原花青素或单独的碳点均无法同时满足上述要求。

30、（二）碳点表面的羧基和酚羟基并非孤立存在，而是与原花青素前体的典型生物官能团一脉相承的协同组合。羧基带负电荷，可通过静电作用与α-突触核蛋白纤维表面的正电区域结合；酚羟基可作为氢键供体，与纤维β-折叠结构中的肽键羰基形成氢键；同时，碳核的π-π共轭结构可与纤维中芳香族氨基酸残基产生疏水相互作用。上述三种作用力（静电、氢键、疏水）的协同叠加，使碳点对α-突触核蛋白纤维的结合亲和力显著高于单一作用模式，从而实现对病理纤维的特异性靶向。这种多点识别机制是原花青素单体所不具备的单体缺乏纳米尺寸带来的局部浓度效应，也缺乏碳核π-π共轭结构带来的额外疏水相互作用。

31、（三）现有技术大多停留在抑制α-突触核蛋白单体异常聚集的阶段，对已形成的成熟纤维束手无策。本技术的碳点通过表面官能团与纤维核心β-折叠结构的特异性结合，破坏纤维的稳定性，诱导其解离为短片段，实现主动降解。同时，碳点通过抑制单体向纤维的构象转变，阻断新纤维的生成。降解已形成纤维与抑制新纤维生成两种功能并非独立运作，而是形成时间维度上的协同：对已沉积病理纤维的清除为细胞功能恢复创造条件，对新纤维生成的抑制则防止病理进展的恶性循环。这种双重功能协同，使碳点在干预纤维化过程中展现出单一功能药物所不具备的治疗韧性。

32、（四）α-突触核蛋白纤维的神经毒性并非单一机制驱动，而是通过“纤维沉积→ros生成→线粒体损伤→ros进一步升高→神经元死亡”的恶性循环级联放大。本技术的碳点针对上述病理链条的多个节点同时发力，形成协同干预网络：在上游，碳点降解纤维并抑制聚集，消除ros生成的初始诱因；在中游，碳点通过原花青素来源的抗氧化活性清除已生成的ros，缓解氧化应激；在下游，碳点保护线粒体膜电位，恢复细胞的能量代谢功能，打断ros与线粒体损伤之间的正反馈循环。三个靶点的协同干预并非简单的效果相加，而是通过打断病理恶性循环产生指数级的保护增益，单独清除ros而不降解纤维，则纤维持续诱导ros生成；单独保护线粒体而不清除ros，则ros持续损伤线粒体。只有同时作用于上游、中游和下游，才能从根本上阻断神经元死亡的路径。

33、（五）碳点的光致发光特性源于其内部的石墨化碳核与表面缺陷态的协同发光机制，这一特性并非原花青素单体所具备，而是碳点化过程的增值效应。该荧光特性使碳点在发挥纤维降解和神经保护作用的同时，能够作为成像探针实时追踪其在体内的分布和纤维降解的动态过程。治疗（纤维降解）与诊断（荧光成像）两种功能集成于同一纳米颗粒，避免了传统诊疗分离模式下治疗剂与造影剂分别给药带来的剂量协调难题和代谢负担，实现了真正意义上的诊疗一体化（theranostics）。

34、（六）细胞内病理聚集的有效降解与病理磷酸化的显著下调：本技术提供的pcds在sh-sy5y细胞模型中，能够显著降解由外源α-syn pffs诱导形成的内源性α-syn病理性聚集体。western blot结果显示，pcds处理后，高分子量sds抵抗性聚集带（>180kda）显著减弱，同时二聚体（~35kda）和三聚体（~60kda）信号增强，表明pcds能够有效解离已形成的致密聚集体，恢复α-syn的可溶性低聚状态。更重要的是，pcds能够显著降低α-syn在ser129位点的病理磷酸化水平。在α-syn pffs诱导的细胞模型中，p-α-syn表达量显著升高，而pcds共处理后p-α-syn水平降至接近正常对照组。免疫荧光染色进一步证实，pcds处理后细胞内p-α-syn阳性包涵体的数量和荧光强度均大幅减少。这一效果提示pcds不仅通过物理作用清除聚集体，还可能通过改变蛋白构象或阻断激酶识别底物，从上游减少病理磷酸化修饰，实现了对α-突触核蛋白病理过程的更深层次干预。

35、（七）高效的血脑屏障穿透能力：通过体外transwell bbb模型验证，本技术pcds在60-90分钟内的跨膜转运效率达到90%以上，而原花青素单体（pc）的转运效率不足20%。pcds的纳米尺寸效应和表面官能团特性赋予其优异的bbb穿透能力，解决了天然多酚类化合物中枢神经系统递送效率低下的难题，为碳点在体内到达病变部位并发挥治疗作用提供了直接证据。

36、综上所述，本技术通过原花青素碳源的选择、可控水热碳化工艺的设计以及多官能团表面的保留，创造了一种在材料结构、表面化学、功能输出和病理干预四个层面均具有内在协同性的功能继承型碳点。所述碳点并非原花青素与碳点的简单混合物，而是在纳米尺度上重新组织的、具有新涌现特性的统一体。正是这种深层次的协同作用，使碳点能够突破现有技术仅抑制聚集或仅促进清除的功能单一性瓶颈，实现对α-突触核蛋白纤维化过程的主动、多靶点、系统性干预，为神经退行性疾病的治疗提供了全新的材料平台和技术路线。