一种基于跨尺度层级封装的益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球及其制备方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一种益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球及其制备方法与应用。

背景技术：

1、益生菌与脂溶性功能因子的共递送体系能够同时发挥肠道菌群调节、活性物质补充以及肠道微环境改善等作用，是功能食品、营养递送和肠道健康干预领域的重要发展方向。益生菌能够通过调节肠道菌群组成、改善肠道屏障功能和参与免疫稳态调控发挥有益作用，但其在食品加工、储藏以及胃肠道递送过程中容易受到胃酸、胆盐、消化酶、氧化环境和机械剪切等因素影响，导致活菌数量下降和功能活性降低。因此，提高益生菌在复杂环境中的稳定性和递送效率，是益生菌应用中的关键问题。

2、岩藻黄素是一种来源于褐藻等海洋资源的脂溶性类胡萝卜素，具有较好的抗氧化、抗炎及肠道健康调节潜力。然而，岩藻黄素水溶性差，易受光、热、氧及胃肠道环境影响而发生降解，限制了其在食品和营养递送体系中的应用。将岩藻黄素负载于玉米醇溶蛋白纳米颗粒中，可利用玉米醇溶蛋白的疏水相互作用和自组装特性改善岩藻黄素的水相分散性和包载稳定性。但是，该类蛋白基纳米颗粒在复杂离子环境、多糖凝胶体系和胃肠消化过程中仍可能发生聚集、结构松散或活性物质提前释放，难以单独实现稳定递送。

3、将益生菌与岩藻黄素纳米颗粒共同包封于凝胶微球中，一方面可利用凝胶网络为益生菌和岩藻黄素纳米颗粒提供外部物理屏障，减少胃酸、胆盐和消化酶的直接作用；另一方面，益生菌与岩藻黄素在肠道环境中具有潜在的功能互补作用，可同时实现微生态调节和脂溶性活性因子补充。尤其是当益生菌表面预先构建壳聚糖-脂质双层涂层后，菌体自身已具有一定界面保护能力；进一步将双层涂层益生菌与玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒共同包埋于多糖复合凝胶网络中，可提高益生菌与岩藻黄素的共存稳定性和包封均匀性，并增强其在胃肠道环境中的保护与递送效果。因此，如何实现双层涂层益生菌与岩藻黄素纳米颗粒的同步包封、稳定共存和有效保护，是益生菌与脂溶性功能因子共递送过程中亟需解决的技术问题。

4、现有益生菌微胶囊技术多采用海藻酸钠、果胶、壳聚糖、蛋白质或其复合壁材进行包埋。

5、专利 cn112956698a 公开了一种包埋益生菌微胶囊的爆爆珠及其制备方法，其主要采用果胶、海藻酸钠等材料包埋益生菌，并通过滴入氯化钙溶液和二次包埋形成益生菌爆爆珠。该方法能够在一定程度上提高益生菌的胃肠道耐受性，但其包封对象主要为益生菌，未涉及双层涂层益生菌与脂溶性功能纳米颗粒的协同递送；同时，普通滴加和静置固化过程容易受到溶液黏度、滴加速度和交联扩散过程影响，微球尺寸、球形度及内部结构均一性仍有待提高。

6、专利 cn117016791a 公开了一种益生菌包埋保护方法，该方法通过黄原胶、海藻酸钠、乳清蛋白、低聚异麦芽糖、氢化植物油等组分构建复合壁材体系，以提高益生菌在酸、胆盐及储藏条件下的稳定性。该方案主要围绕益生菌的包埋保护展开，其技术效果集中于提高活菌在不利环境中的存活率，并未进一步引入脂溶性活性物质的纳米化递送设计。尤其是，该方法未涉及壳聚糖-脂质双层涂层益生菌与玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒的共同限域包封，也未针对蛋白基疏水纳米颗粒在多糖凝胶网络中的相容性、分散稳定性和释放调控进行设计。因此，该方案与本发明所要解决的益生菌和岩藻黄素纳米颗粒协同递送问题存在明显差异。

7、专利 cn120419597a 公开了一种基于分子装甲技术的益生菌双层羽衣的制备及其应用，其通过壳寡糖、果胶、明胶或乳清分离蛋白等材料在益生菌表面构建双层包覆结构，以提高益生菌的热稳定性、冻融稳定性、储藏稳定性和模拟消化稳定性。该方案主要针对单个益生菌细胞表面的涂层保护，能够改善益生菌自身稳定性，但并未进一步构建外部水凝胶微球载体，也未涉及与岩藻黄素等脂溶性活性因子纳米颗粒的共同包封。因此，该类单细胞涂层体系在多组分共递送、活性因子限域保护和微球化应用方面仍存在不足。

8、综上，现有益生菌包埋与保护技术虽然能够在一定程度上提高益生菌对胃酸、胆盐、热处理、冻融或储藏等不利环境的耐受性，但仍存在以下不足：

9、其一，现有技术多以益生菌单一包埋保护为核心，包封对象主要为裸益生菌或经普通壁材保护的益生菌，缺乏针对双层涂层益生菌与脂溶性功能纳米颗粒的同步包封设计。

10、其二，现有体系通常侧重于通过多糖、蛋白质或脂质等壁材提高益生菌自身稳定性，并未将岩藻黄素等脂溶性功能因子作为共同递送对象进行纳米化包载和结构整合，难以同时解决益生菌保护与脂溶性活性物质稳定递送的问题。

11、其三，单纯的水凝胶微球包埋或单细胞表面涂层保护均存在一定局限。前者主要依赖外部凝胶网络提供物理屏障，难以在菌体界面层面提供精细保护；后者虽然能够提高单个菌体的环境耐受性，但缺乏外部凝胶网络对多组分活性物质的限域、稳定分散和缓释作用。

12、因此，亟需开发一种能够同时包封壳聚糖-脂质双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒的多糖复合凝胶微球体系。该体系通过食品级海藻酸盐、果胶等多糖构建复合凝胶网络，将经界面涂层保护的益生菌与岩藻黄素纳米颗粒共同限域于凝胶基质中，实现益生菌与脂溶性功能因子的同步包封、稳定共存和胃肠道协同保护，从而为功能食品、营养递送和肠道健康调节产品提供一种安全、温和且具有应用潜力的新技术方案。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球及其制备方法与应用。本发明以双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒作为待递送的活性组分，采用海藻酸钠和低甲氧基果胶构建复合多糖凝胶基质，并通过钙离子交联将两类活性组分同步包埋于同一凝胶微球中，从而构建益生菌与岩藻黄素的共递送体系。其中，益生菌表面的壳聚糖-脂质双层涂层有助于减少加工、储藏及胃肠道环境对菌体活性的影响；玉米醇溶蛋白对岩藻黄素进行包载，有助于改善岩藻黄素的水相分散性和稳定性；海藻酸钠与低甲氧基果胶形成的复合凝胶基质能够对两类活性组分进行同步包封和空间限域，降低活性组分在制备、储藏及递送过程中的损失，从而提高益生菌与岩藻黄素在同一递送体系中的共存稳定性，并实现二者的同步递送。该制备过程条件温和，无需高温处理或使用有毒共价交联剂，能够减少制备过程对益生菌活性和岩藻黄素稳定性的影响；所用海藻酸钠、低甲氧基果胶及氯化钙具有良好的食品适用性，所得复合凝胶微球可用于功能食品、营养补充剂或益生菌制品中益生菌与岩藻黄素的共递送。

2、基于上述共递送设计思路，本发明提供一种益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球及其制备方法与应用，其具体技术方案如下。

3、第一，本发明提供一种益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球，所述复合凝胶微球包括由海藻酸钠和低甲氧基果胶经钙离子交联形成的复合凝胶基质，以及共同包埋于所述复合凝胶基质中的双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒。

4、所述双层涂层益生菌为菌体表面依次包覆有壳聚糖层和脂质层的益生菌，具体制备方法参见专利“2025118166955一种原位自组装构筑的双层仿生涂层益生菌及其制备方法与应用”公布的步骤进行。

5、所述玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒为由玉米醇溶蛋白包载岩藻黄素形成的纳米颗粒。

6、优选地，所述复合凝胶基质通过将混合前质量体积浓度为1.0%～3.0%的海藻酸钠溶液与混合前质量体积浓度为0.2%～0.6%的低甲氧基果胶溶液按照1∶1的体积比混合，并经钙离子交联形成。

7、进一步优选地，所述海藻酸钠溶液混合前的质量体积浓度为2.0%，所述低甲氧基果胶溶液混合前的质量体积浓度为0.4%。

8、优选地，所述益生菌为鼠李糖乳酪杆菌gg。

9、优选地，所述玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒的制备方法如下：

10、称取玉米醇溶蛋白溶解于体积分数为70%的乙醇水溶液中，在室温下避光搅拌至完全溶解，得到玉米醇溶蛋白溶液；所述玉米醇溶蛋白溶液的浓度为5~30 mg/ml。称取岩藻黄素溶解于无水乙醇中，得到岩藻黄素溶液。随后将岩藻黄素溶液与玉米醇溶蛋白溶液混合，使玉米醇溶蛋白与岩藻黄素的质量比为5:1~30:1。

11、混合过程中全程避光操作，以减少岩藻黄素降解。配制ph为4.0的水相。在室温搅拌条件下，将上述含有玉米醇溶蛋白和岩藻黄素的乙醇相缓慢加入水相中，使玉米醇溶蛋白在反溶剂作用下自组装形成负载岩藻黄素的纳米颗粒。所述搅拌速度为400~1000 rpm，优选为600 rpm；加入完成后继续避光搅拌30 min，使体系充分稳定。随后采用旋转蒸发、减压挥发或氮气吹扫方式去除体系中的乙醇，并用去离子水补足体积，得到玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒分散液。所得分散液可经低速离心或过滤去除少量大颗粒聚集物，收集均一分散液。于4℃避光保存，用于后续复合凝胶微球的制备。

12、优选的，玉米醇溶蛋白与岩藻黄素的质量比为10:1~25:1，更进一步优选为20:1。

13、第二，本发明还提供上述益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

14、s1、将海藻酸钠溶液与低甲氧基果胶溶液混合均匀，得到复合多糖溶液；

15、s2、将预先制得的双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒共同加入所述复合多糖溶液中并分散均匀，得到成珠前驱液；

16、s3、使所述成珠前驱液形成液滴，并使所述液滴进入氯化钙交联液中进行钙离子交联，使同一液滴中的双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒共同包埋于交联形成的复合凝胶基质中；

17、s4、交联完成后，收集并洗涤所得凝胶微球，得到所述益生菌-岩藻黄素共递送复合凝胶微球。

18、优选地，步骤s1中，所述海藻酸钠溶液混合前的质量体积浓度为1.0%～3.0%，所述低甲氧基果胶溶液混合前的质量体积浓度为0.2%～0.6%，所述海藻酸钠溶液与低甲氧基果胶溶液的体积比为1∶1。

19、进一步优选地，步骤s1中，所述海藻酸钠溶液混合前的质量体积浓度为2.0%，所述低甲氧基果胶溶液混合前的质量体积浓度为0.4%。

20、优选地，步骤s3中，所述氯化钙交联液的质量体积浓度为5%。

21、优选地，步骤s3采用离心驱动方式使所述成珠前驱液形成液滴，具体包括：将所述成珠前驱液装入设有出液针头的供液容器中，将所述供液容器设置于离心装置中，在500～1000 rpm的离心转速下，使所述成珠前驱液经所述出液针头排出并形成液滴，所述液滴进入设置于收集容器中的氯化钙交联液中进行交联，离心驱动时间为4～15 min。

22、进一步优选地，所述出液针头为22g针头，所述出液针头的针尖与氯化钙交联液液面的距离为2 cm。

23、第三，本发明进一步提供所述复合凝胶微球在功能食品、营养补充剂、益生菌制品、脂溶性功能因子递送产品或肠道健康调节产品中的应用。所述复合凝胶微球可用于益生菌与岩藻黄素的同步递送、胃肠道保护递送、活性菌体稳定化保护以及脂溶性功能因子的水凝胶微球化递送。

24、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

25、（1）构建了益生菌与脂溶性功能因子的同载化共递送体系。本发明将双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒共同分散于海藻酸钠-低甲氧基果胶复合多糖体系中，并经钙离子交联同步包埋于同一凝胶微球内，实现活性菌体与脂溶性功能因子的同载化、同步包封和共同递送，拓展了传统凝胶微球由单一活性组分包埋向多组分复合递送的应用形式。

26、（2）提高了不同性质活性组分在同一水相体系中的相容性。益生菌菌体与岩藻黄素在粒径、表面性质、亲疏水性及环境敏感性等方面存在明显差异。本发明分别采用壳聚糖-脂质双层涂层对益生菌进行界面调控，并采用玉米醇溶蛋白对岩藻黄素进行纳米化包载，使两类性质不同的活性组分能够较为均匀地分散于复合多糖溶液中，从而有利于提高成珠前驱液的分散均一性及凝胶微球内活性组分的分布稳定性。

27、（3）增强了益生菌在制备、储藏及胃肠道环境中的稳定性。壳聚糖-脂质双层涂层能够减少外界环境与菌体表面的直接接触，海藻酸钠和低甲氧基果胶经钙离子交联形成的复合凝胶基质能够进一步限制菌体迁移并缓冲外界环境变化，从而有利于降低制备、储藏以及胃肠道递送过程中酸、胆盐和消化酶等因素对益生菌活性的影响。

28、（4）改善了岩藻黄素在复合凝胶体系中的分散和包载状态。玉米醇溶蛋白对岩藻黄素进行包载后，可降低岩藻黄素直接暴露于水相环境中的程度，改善其在成珠前驱液中的分散性，减少游离岩藻黄素在混合及交联过程中发生聚集、析出、提前渗漏或降解的风险，从而有利于提高岩藻黄素在复合凝胶微球中的包封稳定性。

29、（5）复合多糖凝胶基质兼具成型性和包封适配性。本发明采用海藻酸钠与低甲氧基果胶构建复合多糖凝胶体系，通过调节两种多糖的浓度及配比，可改善成珠前驱液的流动性、黏度及离子交联性能，使其能够同时容纳双层涂层益生菌和玉米醇溶蛋白-岩藻黄素纳米颗粒，并形成结构较为稳定的复合凝胶微球。

30、（6）制备条件温和且具有良好的食品应用基础。本发明主要采用海藻酸钠、低甲氧基果胶、玉米醇溶蛋白、壳聚糖及脂质等食品适用性较好的材料，并通过钙离子交联完成凝胶微球制备，制备过程中无需高温处理或使用有毒共价交联剂，有利于保持益生菌活性和岩藻黄素稳定性。所得复合凝胶微球可用于功能食品、营养补充剂或益生菌制品中益生菌与岩藻黄素的共递送。