一株具有增效Bt蛋白杀虫活力和抑菌作用的成团泛菌PxG45及其应用

一株具有增效bt蛋白杀虫活力和抑菌作用的成团泛菌pxg45及其应用
技术领域
1.本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及一株具有增效bt蛋白杀虫活力和抑菌作用的成团泛菌pxg45及其应用。


背景技术：

2.小菜蛾(plutella xylostella)主要危害花菜、甘蓝和西兰花等十字花科蔬菜作物，是危害十字花科蔬菜作物最严重的虫害之一，每年因小菜蛾而造成的经济损失高达50亿美元。苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)作为微生物源低毒杀虫剂，其在昆虫体内的中肠碱性环境中溶解后会释放出原毒素，而后被蛋白酶水解激活，形成具有杀虫活性的毒素蛋白(bt蛋白)，引起肠道麻痹、穿孔及虫体瘫痪等症状，随后进入血腔繁殖，引起败血症，导致虫体死亡，对十字花科蔬菜害虫具有很好的防治效果。但有研究发现，小菜蛾对目前所有的包括bt蛋白在内的杀虫剂均产生了严重的抗药性，其防治越来越困难，亟需开发新的能有效防治小菜蛾的制剂。
3.昆虫肠道栖息着大量的肠道共生菌，对昆虫的生长发育、营养吸收以及机体免疫均具有重要影响。此外，昆虫肠道共生菌被发现具有抑制病原菌的作用。例如，张晓宇等人对分离纯化的红火蚁肠道共生菌进行了体外抑制植物病原真菌的实验，发现红火蚁共生链霉菌streptomyces sp.df-5对植物病原真菌生长具备显著抑制作用(张晓宇et al.,2018)。随着研究的不断深入，越来越多具备抑真菌活性的昆虫肠道菌被分离纯化，如从白蚁肠道中分离的暗灰链霉菌(streptomyces canus)byb02可显著抑制水稻稻瘟病菌和苹果腐烂病菌的生长(zhang et al.,2013)；从褐飞虱肠道中分离的洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)bsnlg8可显著抑制稻瘟病菌(wang et al.,2022)。昆虫肠道共生菌凭借其绿色环保、对人畜无害、低毒甚至无毒以及不易产生抗性等优势成为生防菌的重要来源，不断挖掘新的昆虫肠道共生菌有利于新型生物农药的开发。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株具有增效bt蛋白杀虫活力和抑菌作用的成团泛菌pxg45及其应用。
5.本发明的第一个目的是提供一株成团泛菌(pantoea agglomerans)pxg45菌株。
6.本发明的第二个目的是提供所述菌株或其培养液在提高bt蛋白杀虫活性或在制备bt蛋白增效杀虫剂中的应用。
7.本发明的第三个目的是提供一种bt蛋白增效杀虫剂。
8.本发明的第四个目的是提供所述菌株或其培养液在防治十字花科蔬菜害虫或在制备用于防治十字花科蔬菜害虫的产品中的应用。
9.本发明的第五个目的是提供一种用于防治十字花科蔬菜害虫的制剂。
10.本发明的第六个目的是提供所述菌株或其培养液在抑制植物病原真菌或在制备
抑制植物病原真菌的产品中的应用。
11.本发明的第七个目的是提供一种植物病原真菌抑菌剂。
12.本发明的第八个目的是提供所述菌株或其培养液在防治植物真菌病害或在制备防治植物真菌病害的产品中的应用。
13.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
14.本发明提供了一株成团泛菌(pantoea agglomerans)pxg45菌株，所述菌株分离自小菜蛾中肠，为小菜蛾肠道共生菌，具有增效bt蛋白杀虫活力和抑制希金斯炭疽菌等植物病原真菌的作用。本发明所述成团泛菌(pantoea agglomerans)pxg45菌株于2021年09月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61623，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。
15.本发明请求保护所述pxg45菌株或其培养液在提高bt蛋白杀虫活性或在制备bt蛋白增效杀虫剂中的应用。
16.本发明所述pxg45菌株或其培养液也包括由pxg45菌株或其培养液制成的制剂，例如由pxg45菌株或其培养液制成的菌剂。
17.具体地，本发明所述pxg45菌株可通过扩大培养后离心收集菌体得到，所述pxg45菌株的培养液即为其培养所得的菌液。
18.本发明还提供了一种bt蛋白增效杀虫剂，所述杀虫剂中含有bt蛋白和所述pxg45菌株或其培养液。
19.本发明还请求保护所述pxg45菌株或其培养液在防治十字花科蔬菜害虫或在制备用于防治十字花科蔬菜害虫的产品中的应用。
20.本发明还提供了一种用于防治十字花科蔬菜害虫的制剂，所述制剂中含有bt蛋白和所述pxg45菌株或其培养液。
21.可选地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫、黄曲条跳甲、小地老虎中的一种或几种。
22.具体地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。
23.具体地，所述bt蛋白为cry1ac原毒素。
24.本发明还请求保护所述pxg45菌株或其培养液在抑制植物病原真菌或在制备抑制植物病原真菌的产品中的应用。
25.本发明还提供了一种植物病原真菌抑菌剂，所述抑菌剂中含有所述pxg45菌株或其培养液。
26.具体地，所述植物病原真菌为希金斯炭疽菌(colletotrichum higginsianum)、刺盘孢炭疽菌(colletotrichum camelliae)、茄链格孢菌(alternaria solani)、丁香假单胞菌杨梅致病变种(pseudomonas syringae pv.myricae)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)中的一种或多种。
27.具体地，所述尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)。
28.本发明还请求保护所述pxg45菌株或其培养液在防治植物真菌病害或在制备防治植物真菌病害的产品中的应用。
29.本发明还提供了一种用于防治植物真菌病害的制剂，所述抑菌剂中含有所述
pxg45菌株或其培养液。
30.具体地，所述植物真菌病害是由希金斯炭疽菌、刺盘孢炭疽菌、茄链格孢菌、丁香假单胞菌杨梅致病变种、稻瘟病菌和/或尖孢镰刀菌引起的。
31.具体地，所述尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
32.本发明还提供了一种防治十字花科蔬菜害虫的方法，所述方法为将所述pxg45菌株或其培养液与bt蛋白制备所得的产品施于十字花科蔬菜害虫的食物上，引诱十字花科蔬菜害虫采食。
33.具体地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。
34.本发明还提供了一种防治植物真菌病害的方法，所述方法为将由pxg45菌株或其培养液制成的抗菌剂喷施于病原菌侵染部位。
35.具体地，所述植物真菌病害是由希金斯炭疽菌、刺盘孢炭疽菌、茄链格孢菌、丁香假单胞菌杨梅致病变种、稻瘟病菌和/或尖孢镰刀菌引起的。
36.本发明具有以下有益效果：
37.本发明提供了一株成团泛菌(pantoea agglomerans)pxg45菌株，所述菌株分离自小菜蛾中肠，为小菜蛾肠道共生菌，具有增效bt蛋白杀虫活力和抑制希金斯炭疽菌等植物病原真菌的作用，已于2021年09月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61623，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。本发明所述pxg45菌株可用于制备bt蛋白增效杀虫剂，用于制备防治十字花科蔬菜害虫和植物病原真菌病害的制剂等，具有绿色环保的优点。本发明不仅丰富了生防菌库，还有利于十字花科蔬菜害虫和植物病原真菌病害的防治以及绿色新型农药的开发。
附图说明
38.图1为pxg45菌株在平板上的菌落图片。
39.图2为pxg45菌株的革兰氏染色结果。
40.图3为透射电镜下pxg45菌株的形态特征。
41.图4为pxg45菌株的系统发育分析结果；每一分支上的标示为：genbank序列号 菌株名称。
42.图5为pxg45菌株与cry1ac原毒素对小菜蛾幼虫存活率的影响结果；其中，cry1ac ddh2o表示同时添食cry1ac原毒素以及ddh2o；cry1ac pxg45表示同时添食cry1ac原毒素以及pxg45菌株；pxg45 ddh2o表示同时添食pxg45分离菌以及ddh2o；ddh2o表示为单独添食ddh2o，*p《0.05。
43.图6为pxg45菌株回补对无菌小菜蛾经cry1ac原毒素处理后的存活率的分析结果；注：无菌小菜蛾幼虫n＝60；实验进行三次生物学重复，误差棒表示标准差；采用log-rank(mantel-cox)检验，*p《0.05。
44.图7为pxg45菌株的抑菌能力检测结果；其中，a为希金斯炭疽菌，b为刺盘孢炭疽菌，c为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，d为茄链格孢菌，e为稻瘟病菌，f为丁香假单胞菌杨梅致病变种。
具体实施方式
45.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
46.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
47.本发明实施例中所述pxg45菌株为成团泛菌(pantoea agglomerans)pxg45菌株，其分离自小菜蛾中肠，为小菜蛾肠道共生菌；所述pxg45菌株于2021年09月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为gdmcc no：61623，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。
48.实施例1菌株的分离培养及鉴定
49.本发明所述pxg45菌株的分离培养及鉴定过程如下所示：
50.1、选择性分离培养基的配制
51.lb培养基：10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g nacl，15g琼脂，溶于1l无菌ddh2o中，调ph至7.0；
52.营养琼脂培养基na：3g牛肉膏，10g蛋白胨，5g nacl，15g琼脂，溶于1l无菌ddh2o中，调ph至7.0。
53.2、菌株的分离
54.在无菌条件下，于超净台内解剖小菜蛾3龄幼虫并取出中肠内含物，离心后分取上清液及沉淀，10倍稀释4个浓度梯度后，蘸取稀释10-4
倍后液体分别涂布于lb平板，置于30℃恒温培养箱培养。
55.3、连续纯化培养并拍照
56.待培养基中有单菌落长出后，根据菌落颜色、大小及形态挑取单菌落，每个单菌落至少在lb平板上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照并转接至lb液体培养基中，摇菌至指数生长期时保存于15％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。
57.4、菌株的形态鉴定
58.本发明通过在平板上划线分离单菌落，对pxg45菌株进行革兰氏染色，以及通过超薄切片制样方法(haegeman et al.,2009)使用透射电子显微镜观察pxg45的内部结构，对pxg45菌株的形态进行了鉴定。通过分离纯化与平板划线法所得pxg45菌株的平板照片如图1所示，由图1可知，pxg45菌株的菌落颜色为黄色，菌落呈扁平圆形，中部未见凸起，菌体湿润黏着度高，菌落四周有淡色黄晕。pxg45菌株的革兰氏染色照片如图2所示，由图2可知，革兰氏染色后细菌呈现红色，表明其为革兰氏阴性菌。透射电镜下pxg45菌株的形态特征如图3所示，由图3可知，pxg45菌株是一种不具有鞭毛的杆状细菌。
59.5、菌株的分子鉴定
60.(1)16s rdna鉴定
61.利用细菌基因组dna提取试剂盒(tianamp bacteria dna kit，天根生物公司)抽提保存的pxg45菌株的基因组dna，以提取的dna为模板，用16s rdna通用引物27f(5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系如表1所示，配制好反应体系后轻轻混匀后，短暂离心，置于pcr仪上，pcr扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃，5min；4℃保
存。
62.表1细菌16s rdna pcr扩增体系
[0063][0064]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送广州擎科生物技术有限公司测序。测序所得的pxg45菌株的16s rdna序列如下(seq id no.1)所示：
[0065]
gggtggggcgctacctgcagtcggacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctggggatctgcccgatagagggggataaccactggaaacggtggctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctctcactatcggatgaacccagatgggattagctagtaggcggggtaatggcccacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcgacggggttaataaccctgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgttaagtcagatgtgaaatccccgg gcttaacctgggaactgcatttgaaactggcaggcttgagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaratgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattakataccctgggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtttcccttgaggagtggcttcccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaaatgaagttgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccacggaatttagcagagatgccttagtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcacaaagtgcgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactccgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccatgattacc
[0066]
(2)菌株的系统发育分析
[0067]
根据测序结果进行菌株的系统发育分析。先用chromas软件拼接序列，然后将该序列与ncbi中rrna/its数据库进行blast比对，比对到的最接近的序列的登录号为nr 041978.1，该序列为pantoea agglomerans菌株dsm 3493的16s rna，pxg45菌株的16s rdna序列与其的相似度为94％。另选取pxg45菌株的近缘序列，用clustalw软件进行多序列比对分析，采用mega 4.0软件的最大简约法(mp)对测定的小菜蛾幼虫肠道共生菌16s rdna序列
与部分genbank数据库中相似性最高的序列进行系统发育分析。pxg45菌株的系统发育分析结果如图4所示，由图4可知，菌株pxg45与pantoea agglomerans strain dsm 3493聚为一支，同源性较高，推测可能为同一菌种，pxg45菌株分类单元属于bacteria；pseudomonadota；gammaproteobacteria；enterobacterales；erwiniaceae；pantoea；pantoea agglomerans group。由上述结果可知，本发明筛选获得的所述pxg45菌株为成团泛菌(pantoea agglomerans)，即成团泛菌pxg45菌株，所述菌株于2021年09月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为gdmcc no：61623，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0068]
6、菌株的生理生化特征测定
[0069]
pxg45菌株的生理生化检测参考《常见细菌系统鉴定手册》进行。pxg45菌株的生理生化鉴定结果如表2所示，由表2可知，pxg45可以利用甲基红、果糖、淀粉、d-甘露糖、乳糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇、麦芽糖、d-木糖、纤维二糖和葡萄糖，不能利用h2s、吲哚、柠檬酸盐、乳糖、棉子糖和氧化酶。
[0070]
表2pxg45生理生化鉴定
[0071][0072]
注：“ ”为阳性反应，“﹣”为阴性反应。
[0073]
实施例2pxg45菌株和cry1ac原毒素对小菜蛾的生物测定
[0074]
1、pxg45菌株的活化培养及pxg45菌悬液的制备
[0075]
在超净台中，取6μl pxg45甘油菌接入6ml lb液体培养基中，30℃、200g摇床振荡培养12h；将摇好的菌液以1：100(菌液：培养基)比例接入新鲜lb液体培养基中，30℃，200g放入摇床摇6h；将活化的pxg45的菌液，10,000g离心2min，收集菌体，用相同的体积无菌ddh2o清洗3次，收集清洗好的菌体，加入相同体积的ddh2o制备成菌悬液，取200μl菌悬液使用酶标仪检测od600，调节菌悬液od600为1.0。
[0076]
2、小菜蛾的饲养
[0077]
小菜蛾(dbm-w)的饲养条件为：温度：25
±
1℃，光周期：16h：8h(光:暗)，相对湿度：75％。小菜蛾幼虫使用人工饲料饲养，人工饲料的配方为：酵母粉40克，麦胚粉75克，复合维
生素2克，山梨酸2克，尼泊金2克，抗坏血酸2克，蔗糖20克，萝卜籽6克，琼脂12克，菜籽油2毫升，亚油酸3～4滴和水500毫升；成虫饲喂10％蜂蜜水补充营养，卵用浸过萝卜菜汁的卵卡收集。
[0078]
3、cry1ac原毒素提取方法
[0079]
(1)活化苏云金芽孢杆菌(bt)hd73甘油菌得到种子液，用种子液在lb固体培养基平板上划线，待长出单菌落后，挑取单菌落至lb液体培养基中，220rpm，30℃培养12h，之后以1：100(菌液：培养基)比例转接菌液至1/2lb培养基，220rpm，30℃培养28.5h；
[0080]
(2)4℃，8000g离心10分钟，收集沉淀；
[0081]
(3)1m nacl(预冷)清洗1次，ddh2o(灭菌预冷)清洗1次；
[0082]
(4)用buffer a(50mm na2co3，50mm edta-na2，3％β-me，ph 10.0)重悬，调节ph至9.6～10，100g，冰上孵育1h；
[0083]
(5)4℃，13000g离心20min，收集上清；
[0084]
(6)将收集到的上清用4m的naac-hac调节ph到4.5，4℃过夜孵育；
[0085]
(7)4℃，13000g离心15min，ddh2o清洗2次，用50mm na2co3(ph 9.6)溶解；
[0086]
(8)将cry1ac原毒素储存液用ddh2o稀释至20mol/l；
[0087]
(9)每1g饲料混合250μl样液，在饲喂小菜蛾3龄幼虫前，先饥饿处理4h，饲喂后从24h开始每隔12h统计活虫数量，一直持续到84h。
[0088]
4、cry1ac原毒素对小菜蛾的毒力测定
[0089]
将上述步骤提取得到的cry1ac原毒素用无菌ddh2o稀释成7个不同的浓度(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、200μg/ml)，同时设置一组只含有无菌ddh2o的作为空白对照，每个处理4个重复，每个重复10头虫。每个重复在无菌培养皿(直径9cm)中加入1克人工饲料，每皿在饲料上滴加250μl不同浓度的cry1ac原毒素稀释液，另外加入无菌ddh2o的一组作为空白对照。搅拌均匀后，分别挑入10头饥饿处理约4h的三龄小菜蛾幼虫，挑虫完毕后转移至人工气候箱内饲养，气候箱温湿等条件与正常饲养一致。36h后统计每个皿内活虫数量，并计算对应每个处理的死亡率，参考对照组的死亡率情况，利用abbott公式得到每个处理的校正死亡率(abbott，1987)，然后使用spss 22进行probit分析并计算毒力回归方程的斜率，亚致死剂量(lc25)及其95％置信区间(finney，1971)。
[0090]
表3小菜蛾3龄幼虫对cry1ac原毒素的敏感性测定
[0091][0092]
5、cry1ac原毒素对小菜蛾的处理
[0093]
随机选取160头生长健康且龄期一致的小菜蛾3龄幼虫，饥饿处理3h。将处理好的幼虫分成4组，每一组中再分出4个小组作为重复组，每一个重复组中有10头小菜蛾3龄幼虫；4组处理的配制具体如下所示：
[0094]
组1：用125μl肠道菌pxg45菌悬液(od600为1.0)和125μl ddh2o与1g饲料添食3龄幼虫；
[0095]
组2：用125μl肠道菌pxg45菌悬液(od600为1.0)加125μl 20mol/l cry1ac原毒素
与1g饲料添食3龄幼虫；
[0096]
组3：用125μl 20mol/l cry1ac原毒素加125μl ddh2o与1g饲料添食3龄幼虫；
[0097]
组4：用250μl ddh2o与1g饲料添食3龄幼虫。
[0098]
每隔12h记录一次小菜蛾的存活虫数，直至96h，使用graphpad 8.0软件进行数据处理及图表制作，并用student’s-t test进行差异显著性分析。
[0099]
pxg45菌株与cry1ac原毒素对小菜蛾幼虫存活率的影响如图5所示，由图5所示结果可知，pxg45菌悬液和cry1ac原毒素混合添食3d后，小菜蛾的存活率为37.0963％，添食4d后的存活率为9.27406％；单独添食cry1ac原毒素3d后，小菜蛾的存活率为58.2349.1％，添食4d后的存活率为51.272％，单独添食pxg45菌株4天后，小菜蛾的存活率为84.4581％，表明pxg45菌株对cry1ac原毒素具有显著增效作用，达到差异显著水平(*p《0.05)。
[0100]
实施例3pxg45菌株对小菜蛾cry1ac原毒素的增效作用
[0101]
1、配制抗生素溶液
[0102]
分别配制1mg/ml环丙沙星、1mg/ml左氧氟沙星和2mg/ml甲硝唑。
[0103]
2、收集卵卡并消毒
[0104]
收集小菜蛾产卵盛期产好的卵卡，置于5
‰
次氯酸钠消毒液中先消毒10分钟，然后置于清水中浸泡两次，每次5分钟，用吸水纸吸干后置于养虫盒内，1～2天待虫孵化后添加饲料喂养。
[0105]
3、抗生素饲喂处理
[0106]
称取4克小菜蛾人工饲料于无菌塑料杯中，然后分别加入333μl以上配制好的环丙沙星、左氧氟沙星以及甲硝唑抗生素溶液为处理组，搅拌均匀后取适量置于养虫盒内，之后每天更换一次新鲜饲料，从初孵幼虫开始一直持续到3龄初幼虫，处理前24h改为饲喂正常饲料；对照组从孵化开始一直饲喂正常饲料。
[0107]
4、肠道菌清除效果的检测
[0108]
处理组与对照组分别随机取10头虫，解剖取中肠内容物，无菌ddh2o梯度稀释103～104倍，取100μl涂板lb固体培养基(无抗性)，置于30℃培养箱内培养，48h后检测有无细菌生长。
[0109]
5、回补肠道分离菌
[0110]
取出已经做好菌种鉴定的的肠道分离菌甘油菌，剔除重复菌种后，分别按照1：1000比例转接于lb液体培养基中，过夜活化培养得到种子菌，种子菌按照1：100的比例转接至新鲜lb培养基中培养约6h。培养后将菌液离心，富集菌体，无菌ddh2o重复洗涤3次以去除残留培养基，菌体用ddh2o重悬后稀释到od
600
为1.0，然后称取1克小菜蛾人工饲料置于90mm无菌培养皿中，滴加250μl上述稀释后的菌悬液，搅拌均匀后每皿挑入10头三龄小菜蛾无肠道菌幼虫。
[0111]
将分离出的小菜蛾肠道共生菌pxg45菌株对无肠道菌种群进行回补，并测定其对cry1ac原毒素的敏感性，结果如图6所示。由图6可知，pxg45菌株的回补可显著提高小菜蛾幼虫对cry1ac原毒素的敏感性(*p《0.0001，log-rank(mantel-cox)检验)，pxg45菌株的回补均降低了小菜蛾的半数生存期(median survival time)，使小菜蛾半数生存期由2.5天降低至1.5天。
[0112]
实施例4pxg45菌株对植物病原真菌的抑制活性
[0113]
1、pxg45菌液的制备
[0114]
将-80℃保存的甘油菌以1：100接入新鲜液体lb培养基，220rpm，37℃活化12h获得种子菌，再以1：100的比例取种子液接于新鲜lb培养基，220rpm，37℃摇4h获得具有较强活性的菌液，测定od值，配制成1
×
107cfu/ml的菌液。
[0115]
2、pxg45抑菌能力检测
[0116]
pxg45菌株对植物病原真菌的抑菌能力采用平板对峙方法测定(fernandes et al.,2021)，将活化的植物病原菌菌饼接种在pda培养基中心，在距菌饼2.5cm的对称处划线接种pxg45菌株的菌液，以仅接种了病原菌的平板作为对照，在25
±
1℃的温度和75
±
5％的湿度条件下倒置培养，根据病原菌的生长周期，测定处理组和对照组的菌落直径，评估pxg45菌株的抑菌作用。供试植物病原菌为希金斯炭疽菌(c.higginsianum)、刺盘孢炭疽菌(c.camelliae)、茄链格孢菌(a.solani)、丁香假单胞菌杨梅致病变种(p.syringae pv.myricae)、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(f.oxysporum f.sp.cubense race 4)和稻瘟病菌(m.oryzae)。
[0117]
抑制率％＝[(对照组中病原体菌落直径-处理组中病原体菌落直径)/(对照组中病原体菌落直径)]
×
100％。
[0118]
3、实验结果
[0119]
pxg45菌株的抑菌能力检测结果如图7所示，由图7可知，pxg45菌株能显著抑制希金斯炭疽菌(c.higginsianum)，刺盘孢炭疽菌(c.camelliae)，茄链格孢菌(a.solani)，丁香假单胞菌杨梅致病变种(p.syringae pv.myricae)，稻瘟病菌(m.oryzae)和尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(f.oxysporum f.sp.cubense race 4)的生长。
[0120]
希金斯炭疽菌在培养皿中培养8d后的直径48.84
±
0.73mm，其与pxg45菌株在培养皿中培养8d后的直径为24.93
±
0.33mm；刺盘孢炭疽菌在培养皿中培养7d后的直径57.43
±
0.42mm，其与pxg45菌株在培养皿中培养7d后的直径为28.71
±
0.19mm；尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种在培养皿中培养5d后的直径为74.55
±
0.84mm，其与pxg45菌株在培养皿中培养5d后的直径为34.96
±
0.39mm；茄链格孢菌在培养皿中培养6d后的直径为73.45
±
0.40mm，其与pxg45菌株在培养皿中培养6d后的直径为33.48
±
0.17；稻瘟病菌在培养皿中培养7d后的直径为47.91
±
0.61mm，其与pxg45菌株在培养皿中培养7d后的直径为23.44
±
0.74mm；丁香假单胞菌杨梅致病变种在培养皿中培养6d后的直径为83.45
±
0.22mm，其与pxg45菌株在培养皿中培养6d后的直径为83.45
±
0.22mm；将上述结果代入抑菌率计算公式进行计算可知，pxg45菌株对所述的6种致病真菌均显示出很强的抑菌效果，抑菌率在49％以上。
[0121]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。