用二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）抑制剂治疗自身免疫病的制作方法

用二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)抑制剂治疗自身免疫病
1.本公开涉及dhodh抑制剂单独或与另一种疗法组合用于治疗自身免疫病的用途。
2.背景
3.自身免疫病病理的特征是身体用畸变t细胞和/或b细胞攻击自身。虽然“自身免疫病”涵盖许多特定疾病，但存在一些在根本上相似的潜在机制驱动生物过程。许多自身免疫病的常见症状包括：疲乏、关节疼痛和肿胀、皮肤问题、异常疼痛或消化问题、反复发热、腺体肿胀。
4.自身免疫病的风险因素包括遗传(特别是多发性硬化(ms))、肥胖、吸烟和某些药物(诸如抗生素、他汀类药物和一些用于降低血压的药物)。
5.由此引发的疾病难以诊断、治疗，并且可能使人非常衰弱。患有自身免疫病的患者存在真正未得到满足的需求。在一些情况下，当ms非常严重时，方法是清除患者的免疫系统并且进行干细胞移植。这是一种危险、困难且昂贵的程序，并且是最后的治疗方法。
6.嘌呤和嘧啶核苷酸在dna和rna合成以及膜脂质生物合成和蛋白质糖基化中起关键作用。它们是成熟t淋巴细胞发育和存活所必需的。t淋巴细胞的活化与嘌呤和嘧啶池的增加相关联，其继而导致参与嘌呤和嘧啶从头合成的关键酶的活性显著增加。
7.据信嘧啶对控制t细胞生命周期从早期到中期s期的进展很重要。对嘧啶的抑制还引起活化t细胞的凋亡。
8.类似地，嘧啶的生物合成在活化b细胞的生命周期中也很重要。
9.虽然不希望受理论的约束，但本发明人认为阻断嘧啶的生物合成将导致在自身免疫病中具有异常活性的活化t细胞和/或b细胞中的细胞周期停滞和/或细胞凋亡。
10.二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)是催化嘧啶生物合成途径的第四步(即，二氢乳清酸盐转化为乳清酸盐，同时经由黄素单核苷酸中间体将电子转移到泛醌(辅因子q))的酶(loffler moi cell biochem，1997)。与寄生虫(恶性疟原虫)(mcrobert等认moi biochem parasitol 2002)和细菌(大肠杆菌)仅仅将该从头途径作为嘧啶的来源相比，哺乳动物细胞具有额外的补救途径。
11.在稳态增殖期间，独立于dhodh的补救途径似乎足以为细胞供应嘧啶碱。但是，在具有高周转率的细胞中，需要从头途径以便增殖。在这些细胞中，dhodh抑制通过抑制dna合成并且最终抑制细胞增殖来停止细胞周期进程(breedveld f.c.ann rheum dis 2000)。
12.有人认为，抑制线粒体细胞色素bc1(电子传递链复合体iii的组分)将导致p53的活化，然后诱导细胞凋亡。线粒体呼吸链经由线粒体酶二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)与从头嘧啶生物合成途径偶联。
13.各dhodh抑制剂的药物特征差异极大，例如来氟米特(leflunomide)的副作用包括动脉高血压、骨髓抑制、恶心和脱发。布喹那(brequinar)通常仅用作模型化合物，因为临床试验表明该分子在体内缺乏必要的活性。vidofludimus是一种新一代dhodh抑制剂，其抑制活化淋巴细胞产生促炎性细胞因子(诸如il-17)。然而，后者被认为与dhodh活性无关。
14.虽然dhodh抑制剂作为治疗药物一直受到关注，但很难找到平衡所有必要标准的分子，以提供在体内有效的治疗药物。
15.本公开提供了一种特异性dhodh抑制剂aslan003在自身免疫病诸如多发性硬化、自身免疫性皮肤病和炎症性肠病(例如，克罗恩氏病)的治疗中的用途。
16.aslan003对自身免疫病的根本原因(即畸变t细胞和/或b细胞)具有活性，这在体内令人惊讶地转化为对自身免疫病的广谱活性，其中脱靶效应(特别是肝毒性)极小。aslan003对dhodh具有高亲和力并且在临床上有效。aslan003是一种新一代dhodh抑制剂，其耐受性良好，并且为患者提供出色的效果。它能够对患者的生活质量产生积极影响，以控制疾病状态并且阻止其进展和/或使疾病缓解。有利地，具有较低代谢负担的健康细胞通常不受治疗的影响。治疗的平衡特性对患者极为有益。
17.虽然不希望受理论的约束，但据信在一个实施例中，本发明的治疗为疾病修饰治疗。即，经过一段时间的治疗后，身体能够自我重置并且使自身免疫病进入缓解期，例如无需继续施用该疗法或其中继续以低剂量施用该疗法以用于维持。


技术实现要素：

18.本公开汇总于以下段落中：
19.1.一种治疗患者的自身免疫病的方法，其包括施用治疗有效量的dhodh抑制剂2-(3，5-二氟-3
′
甲氧基联苯基-4-基氨基)烟酸或其药用盐。
20.1a一种dhodh抑制剂2-(3，5-二氟-3
′
甲氧基联苯基-4-基氨基)烟酸或其药用盐，其用于治疗患有或疑似患有自身免疫病的患者。
21.1b dhodh抑制剂2-(3，5-二氟-3
′
甲氧基联苯基-4-基氨基)烟酸或其药用盐在制造用于治疗自身免疫病的药物中的用途。
22.2.根据段落1、1a或1b所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病选自包含以下项或由以下项组成的组：化脓性汗腺炎、硬皮病(系统性巩膜炎)、扁平苔藓、硬斑病、银屑病、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、子宫内膜异位症、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、中轴型脊椎炎、幼年型关节炎、复发性风湿病、银屑病关节炎、类风湿关节炎、肉状瘤病、系统性红斑狼疮(sle)、未分化结缔组织病(uctd)、多发性硬化ii型、不宁腿综合征、视神经炎、葡萄膜炎、巩膜炎、蚕食性角膜溃疡、梅尼埃病、格雷夫斯眼病、视神经脊髓炎、susac综合征和红斑狼疮。
23.3.根据段落1、1a或1b所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为炎症性肠病，例如乳糜泻、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，诸如克罗恩氏病。
24.4.根据段落1、1a或1b所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为皮肤病变。
25.5.根据段落1、1a或1b至4中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病的特征在于畸变t细胞应答。
26.6.根据段落1、1a或1b至5中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病的特征在于畸变b细胞应答。
27.7.根据段落1、1a或1b至6中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病例如通过标准护理药物未得到充分控制。
28.8.根据段落1、1a或1b至7中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为重症。
29.9.根据段落1、1a或1b至8中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病并
非以下项中的一者或多者：类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、韦氏肉芽肿病、系统性红斑狼疮、银屑病、肉状瘤病多关节幼年型特发性关节炎、炎症性肠病(诸如溃疡性肠炎和克罗恩氏病)、莱特尔综合征、纤维肌痛或1型糖尿病。
30.10.根据段落1、1a或1b至8中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为炎症性肠病，例如结肠炎，包括溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和/或乳糜泻(及其并发症，诸如关节炎、葡萄膜炎、结节性红斑和黄疸)
31.11.根据段落1、1a或1b至8中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为皮肤病变，例如特应性皮炎(包括自身免疫性孕激素皮炎)、银屑病、红斑(包括结节性红斑)、硬皮病和狼疮。
32.12.根据权利要求1、1a或1b至8中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为类风湿关节炎。
33.13.根据段落1、1a或1b至8中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中自身免疫病为多发性硬化。
34.14.根据段落13所述的方法、抑制剂或用途，其中多发性硬化为复发缓解型多发性硬化。
35.15.根据段落13或14所述的方法、抑制剂或用途，其中多发性硬化为继发进展型多发性硬化。
36.16.根据段落13所述的方法、抑制剂或用途，其中多发性硬化为原发进展型多发性硬化。
37.17.根据段落13至16中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中通过治疗，症状的严重程度降低，例如运动功能、痉挛状态、肌痉挛和/或僵硬得到改善。
38.18.根据段落13至17中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中通过治疗，复发的频率或严重程度降低。
39.19.根据段落1至18中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中畸变t细胞活化得以最小化，例如，t细胞生命周期从早期s期到中间s期的进展受到抑制。
40.20.根据段落19所述的方法、抑制剂或用途，其中存在减少的记忆t细胞的活化。
41.21.根据段落19或20所述的方法、抑制剂或用途，其中th1 t细胞的异常活化受到抑制。
42.22.根据段落1、1a或1b至21中任一项所述的方法，其中th2 t细胞活化不受抑制。
43.23.根据段落1、1a或1b至22中任一项所述的方法，其中畸变b细胞的活化受到抑制，例如通过限制细胞生命周期中s期的进展而受到抑制。
44.24.根据段落1、1a或1b至23中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中刺激异常免疫细胞的凋亡。
45.25.根据段落1、1a或1b至24中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中治疗是针对自身免疫病的爆发。
46.26.根据段落1、1a或1b至25中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中治疗是连续的，例如每剂(诸如每天)100至400mg，特别是每剂(诸如每天)300至400mg，持续至少一段时间，并且任选地维持每剂(诸如每天)例如100至200mg。
47.27.根据段落1、1a或1b至25中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中治疗是间歇
性的或在一段时间后(例如，在定义的终点之后)停止。
48.28.根据段落1、1a或1b至27中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中dhodh抑制剂用作单一疗法。
49.29.根据段落1、1a或1b至27中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中dhodh抑制剂在组合疗法中采用。
50.30.根据段落29所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含独立地选自以下项的治疗：皮质类固醇(例如，口服泼尼松和静脉内甲泼尼龙)、血浆置换(血浆分离)、干扰素β药物、醋酸格拉替雷、芬戈莫德、富马酸二甲酯、富马酸地罗昔美、特立氟胺、西尼莫德、克拉屈滨、奥瑞珠单抗、那他珠单抗、抗cd20药剂或其生物仿制药诸如利妥昔单抗、阿仑单抗以及布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂。
51.31.根据段落29或30所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含缓解或减轻多发性硬化症状的治疗，例如，肌肉松弛剂(诸如巴氯芬、替扎尼定和环苯扎林)、减轻疲乏的药物(诸如金刚烷胺、莫达非尼和哌甲酯)和/或提高步行速度的药物(诸如达伐吡啶)。
52.32.根据段落29至31中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含抗抑郁药，例如，三环类抗抑郁药，诸如氯丙咪嗪。
53.33.根据段落29至32中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含度洛西汀。
54.34.根据段落29至33中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合包含米拉贝隆和/或去氨加压素。
55.35.根据段落29至34中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含干扰素β(ifn-β)，诸如干扰素β-1a或干扰素β-1b。
56.36.根据段落29至35中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含抗cd20药剂或其生物仿制药，例如rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗生物仿制药、gazyva、kesimpta、ocrevus(奥瑞珠单抗)、ruxience、truxima、zevalin、arzerra、acellbia、hlx01、reditux、ritucad或zytux。
57.37.根据段落29至36中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合疗法包含布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂，例如依鲁替尼(ibrutinib)、阿可替尼(acalabrutinib)、泽布替尼(zanubrutinib)、埃沃布鲁替尼(evobrutinib)、abbv-105、非奈布替尼(fenebrutinib)、gs-4059、司培替尼(spebrutinib)和hm71224。
58.38.根据段落29至37中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合不包含甲氨蝶呤。
59.39.根据段落29至38中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合包含嘌呤合成抑制剂，诸如硫唑嘌呤。
60.40.根据段落29至39中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中组合包含生物治疗药物诸如抗体或其结合片段，特别是度普利尤单抗(dupilumab)或抗il-13rα1抗体或其抗原结合片段诸如aslan004，包括其中任何一种的药物制剂。
61.41.根据段落1、1a或1b至40中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中dhodh抑制剂以每天1mg至400mg范围剂量施用，该剂量为例如每天100mg至400mg，诸如每天100mg、200mg、300mg或400mg。
62.42.根据段落1、1a或1b至41中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中dhodh抑制剂每天施用，例如每天施用一次。
63.43.根据段落1、1a或1b至42中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中患者为人。
64.44.根据段落1、1a或1b至43中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中患者的年龄为至少40岁(例如45岁)、至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁。
65.45.根据段落1、1a或1b至44中任一项所述的方法、抑制剂或用途，其中患者患有并存疾病。
66.46.根据段落45所述的方法、抑制剂或用途，其中并存疾病选自肥胖、过敏、哮喘、copd、糖尿病、肾衰竭、心脏病(包括心力衰竭)、癌症、痴呆、肝病及其组合。
附图说明
67.图1为示出aslan003(las186323)在多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型中的体内研究结果的图。该图示出当施用aslan003时的剂量依赖性应答。
68.图2为示出各治疗组的临床评分曲线下面积(auc)平均值的图。
69.图3为示出cns组织学评分的图。
70.图4为示出疾病随时间演变的图。y轴＝临床评分，x轴＝治疗天数，v＝媒介物，f＝阳性对照f，t＝阳性对照t，l＝aslan003(las186323)。缩写后面的数字对应于化合物施用的口服日剂量，单位为mg/kg。
71.图5为示出血液学细胞计数的图。y轴＝细胞计数，wbc＝白细胞，rbc＝红细胞，hgb＝血红蛋白，neut＝中性粒细胞，lymph＝淋巴细胞。对于每种细胞类型，数据条从左到右依次为：初治、v、f-0.1、t-1、t-3、t-10、l-1、l-3、l-10和l-15。
72.v＝媒介物，f＝阳性对照，t＝阳性对照，l＝aslan003(las186323)。缩写后面的数字对应于化合物施用的口服日剂量，单位为mg/kg。
73.图6为示出类风湿关节炎(ra)佐剂性关节炎(aia)模型中各治疗组的(auc)评分。t-3：阳性对照t，3mg/kg，单向anova与bonferroni后检验，*p＜0.05
74.图7为示出raaia模型中各治疗组的x线检查评分。t-3：阳性对照t，3mg/kg。
75.图8a为示出葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的炎症性肠病(ibd)模型中各治疗组的体重的图*。
76.图8b为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的体重变化百分比的图*。
77.图9a为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的粪便硬度评分的图*。
78.图9b为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的血便评分的图*。
79.图10为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的疾病活动指数(dai)的图*。
80.图11为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的肠道通透性试验结果(fitc浓度)的图*。
81.图12a为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的结肠重量的图*。
82.图12b为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的结肠长度的图*。
83.图12c为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的结肠重量/长度的图*。
84.图12d为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的脾脏重量的图*。
85.图13为示出dss诱导的ibd模型中各治疗组的粪便中脂质运载蛋白数据的图*。
86.*误差条指示相较于平均值的标准误差(sem)。
具体实施方式
87.2-(3，5-二氟-3
′‑
甲氧基联苯基-4-基氨基)烟酸(在本文中称为aslan003)具有以下结构：
[0088][0089]
自身免疫病
[0090]
如本文所用的自身免疫病是指个体的免疫系统错误地靶向该个体自身的正常“健康”细胞的任何疾病或病况，特别是特征在于畸变t细胞和/或b细胞活化。
[0091]
如本文所采用的畸变t细胞和/或b细胞活化是指异常t细胞和/或b细胞活化，特别是其中异常细胞识别自身或自身抗原。
[0092]
严重自身免疫病是指其中疾病不受标准护理药物/治疗控制。
[0093]
爆发是指疾病恶化的时期。
[0094]
如本文所采用的“未得到充分控制”是指其中标准护理药物未能减轻或控制症状，特别是其中患者的生活质量受到不利影响。
[0095]
如本文所采用的“定义的终点”是指临床定义的点，例如缓解或稳定疾病。
[0096]
在一个实施例中，aslan003用于维持疗法中，例如以低剂量使用。如本文所采用的维持疗法是指使疾病稳定或保持疾病缓解的持续疗法，例如其中施用低剂量并且特别频繁。例如每天一次或两次给予100至200mg的剂量可用作维持疗法。
[0097]
在一个实施例中，自身免疫病是一种自身免疫性皮肤病，即表现或呈现在皮肤特别是真皮和/或表皮的自身免疫病，诸如狼疮。
[0098]
因此，在一个实施例中，自身免疫病选自包含以下项或由以下项组成的组：急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死性出血性白质脑脊髓炎、艾迪生病、肾上腺功能不全、低糖皮质醇血症、淀粉样变性、强直性脊柱炎、脊柱关节炎、strumpell-marie病、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫缺陷、自身免疫内耳病(aied)、自身免疫性淋巴组织增生综合征(alps)、canale-smith综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎(aip)、自身免疫性多腺体综合征(i型、ii型和iii型)、自身免疫性视网膜病变(ar)、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性荨麻疹、轴索/神经元神经病、巴洛病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼病、乳糜泻、美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发神经病(cidp)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(crmo)、churg-strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮(cp)、克罗恩氏病、炎症性肠病、结肠炎(包括溃疡性结肠炎)、肠炎、回肠炎、cogans综合征、冷凝
集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、嵴病、冷沉球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、杜林氏病、皮肌炎、i型糖尿病、盘状红斑狼疮(dle)、心肌梗死后综合征、子宫内膜异位症、大疱性表皮松解症(eb)和获得性eb(eba)、嗜酸细胞性胃肠炎、食管炎、嗜酸细胞性筋膜炎、schulman综合征、结节性红斑、实验性变态反应性脑脊髓炎、伊文氏综合征、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎(非增殖型：局灶节段性肾小球硬化症和膜性肾小球肾炎；增殖型：iga肾病)、肺出血-肾炎综合征、肉芽肿伴多血管炎(gpa)(以前称为韦氏肉芽肿病)、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、米勒-费希尔综合征、急性运动轴索性神经病、急性运动感觉轴索性神经病、急性全自主神经性神经病变、bickerstaff脑干脑炎、hashimoto脑炎、hashimoto甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病(igan)、berger综合征、同时咽炎性肾小球肾炎(synpharyngitic glomerulonephritis)、iga天疱疮、igg4相关硬化性疾病、免疫调节性不育、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病、间质性膀胱炎、isaac综合征、神经肌肉强直、幼年型关节炎、幼年型肌炎、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状iga皮肤病(lad)、类天疱疮、狼疮(sle)、莱姆病、梅尼埃病、显微镜下型多动脉炎(mpa)、混合性结缔组织病(mctd)、单克隆丙种球蛋白病、蚕食性角膜溃疡、mucha-habermann病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(devic病)、神经肌肉强直、isaac综合征(获得性、副肿瘤性、遗传性)、中性粒细胞减少、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、卵巢炎、斜视性眼阵挛-肌阵挛综合征、睾丸炎、复发性风湿病、熊猫病(与链球菌相关联的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性自身免疫性多器官综合征(pams)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性天疱疮(pnp)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、帕里-龙贝格综合征、parsonnage-turner综合征、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、妊娠性类天疱疮(pg)、寻常型天疱疮(pv)、落叶型天疱疮(pf)、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、poems综合征、结节性多动脉炎(pan)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、孕激素皮炎原发性胆汁性肝硬化、hanot综合征、原发性硬化性胆管炎(psc)、硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、拉斯马森脑炎、慢性局灶性脑炎(cfe)、雷诺现象、反应性关节炎、莱特尔综合征、恢复蛋白相关视网膜病变(rar)、反射感神经营养不良、莱特尔综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、肉状瘤病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、系统性硬化症、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、susac综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、buerger病、血小板减少性紫癜(ttp)、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、未分化结缔组织病(uctd)、葡萄膜炎、大动脉炎、颞动脉炎、buerger病、皮肤血管炎、川崎病、结节性多动脉炎、白塞综合征、变应性肉芽肿性血管炎、皮肤血管炎、过敏性紫癜、显微镜下多血管炎、韦氏肉芽肿病、golfer血管炎、水疱大疱性皮肤病和韦氏肉芽肿病(现称为肉芽肿性多血管炎(gpa))。
[0099]
在一个实施例中，自身免疫病选自包含以下项或由以下项组成的组：anca血管炎、iga肾病(berger病)、寻常型天疱疮/大疱性类天疱疮、itp、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性甲状腺炎(格雷夫斯病)、桥本病、狼疮性肾炎、膜性肾小球肾炎(或膜性肾病)、aps、重症肌无力、视神经脊髓炎、原发性干燥症、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、
皮肤肌炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、白塞病、ipf、系统性硬化症、肝纤维化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、古德帕斯彻氏综合征、肺泡蛋白沉积症、慢性自身免疫性荨麻疹、银屑病、类风湿关节炎、银屑病关节炎、中轴型脊柱炎、移植(包括gvhd)、哮喘、copd、巨细胞动脉炎、难治性自身免疫性细胞减少症、伊文氏综合征(自身免疫性溶血性贫血)、i型糖尿病、肉状瘤病、多发性肌炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、乳糜泻、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、局灶性节段性肾小球硬化症、慢性莱姆病(莱姆疏螺旋体病)、扁平苔藓、僵人综合征、扩张型心肌病、自身免疫性(淋巴细胞性)卵巢炎、获得性大疱性表皮松解症、自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、特应性皮炎、动脉粥样硬化、多发性硬化、拉斯马森脑炎、吉兰-巴雷综合征、获得性神经肌肉强直和卒中。
[0100]
在一个实施例中，自身免疫病选自包含以下项或由以下项组成的组：化脓性汗腺炎、硬皮病(系统性巩膜炎)、扁平苔藓、硬斑病、银屑病、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、子宫内膜异位症、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、中轴型脊椎炎、幼年型关节炎、复发性风湿病、银屑病关节炎、类风湿关节炎、肉状瘤病、系统性红斑狼疮(sle)、未分化结缔组织病(uctd)、多发性硬化ii型、不宁腿综合征、视神经炎、葡萄膜炎、巩膜炎、蚕食性角膜溃疡、梅尼埃病、格雷夫斯眼病、视神经脊髓炎、susac综合征和红斑狼疮。
[0101]
在一个实施例中，自身免疫病选自包含以下项或由以下项组成的组：扁平苔藓、化脓性汗腺炎、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、格雷夫斯病、自身免疫性甲状腺炎、子宫内膜异位症、多发性硬化和视神经炎。
[0102]
多发性硬化(ms)是其中将脑和脊髓神经细胞隔离的髓鞘受损的疾病。由于该损伤，神经系统正确传递信号的能力被破坏。这继而导致一系列严重的身体和精神问题，例如复视、单眼失明、肌肉无力、感觉或协调问题、言语问题、急性或慢性疼痛、膀胱和排便困难、抑郁和心情波动。
[0103]
在大多数情况下，病况在几天内以临床孤立综合征开始，其中大多数人患有运动或感觉问题。症状的过程最初有两种模式，或者为持续几天到几个月的突然恶化发作(称为复发)，然后在大多数情况下得到改善，或者为随时间的推移逐渐恶化而不存在恢复期。复发通常不可预测，并且毫无征兆地发生。
[0104]
多发性硬化的病因目前尚不清楚，尽管潜在的机制被认为是髓鞘受到个体自身免疫系统的破坏，即多发性硬化至少部分地被视为自身免疫病。它是影响中枢神经系统的最常见的免疫介导的疾患，全球约有230万人受到影响。但是，有许多自身免疫病对众多患者的生活产生了严重的负面影响。
[0105]
在一个实施例中，自身免疫病为多发性硬化(ms)。多发性硬化通常进一步分为四种变体之一：临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、原发进展型ms(ppms)和继发进展型ms(spms)。因此，在一个实施例中，自身免疫病选自包含cis、rrms、ppms和spms的组。
[0106]
复发缓解型ms(rrms)的特征在于不可预测的复发，随后是数月至数年的相对平静(缓解)期，在相对平静期内没有新的疾病活动迹象。该病况的典型表现为进行性、持续脱髓鞘和相关的轴突丧失。在一个实施例中，自身免疫病为rrms。
[0107]
发作也称为复发或恶化(在本文中也称为爆发)，之后是部分或完全恢复(缓解)期。在缓解期间，所有症状可能全部消失，或者一些症状可能持续并且成为永久性的。但是，在缓解期间无明显的疾病进展。rrms可进一步描述为活动性(在指定时间段内复发和/或有
新的mri活动的证据)或非活动性以及恶化(复发后确认的残疾增加)或无恶化。
[0108]
复发缓解型亚型通常始于临床孤立综合征(cis)。在cis中，患者有提示脱髓鞘的发作，但不符合多发性硬化的标准。经历cis的30％至70％的患者随后发展为ms。在一个实施例中，自身免疫病为cis。
[0109]
原发进展型ms(ppms)发生在大约10％至20％的个体中，其在初始症状后无缓解。它的特征在于从发作即进展为残疾，没有或只有偶尔和轻微的缓解和改善。在一个实施例中，自身免疫病为ppms。
[0110]
继发进展型ms(spms)发生在大约65％的最初患有复发缓解型ms的患者，他们最终在急性发作之间出现进行性神经功能衰退，没有任何明确的缓解期。偶尔会出现复发和轻微缓解。spms可进一步描述为活动性(在指定时间段期间复发和/或新的mri活动的证据)或不活动性，以及进展(残疾随时间推移而累积的证据，伴有或不伴有复发或新的mri活动)或无进展。在一个实施例中，自身免疫病为spms。
[0111]
在一个实施例中，疾病为慢性炎症性脱髓鞘性多发神经病。
[0112]
在一个实施例中，疾病为横贯性脊髓炎。
[0113]
在一个实施例中，疾病为视神经脊髓炎。
[0114]
在一个实施例中，自身免疫病为以下项中的一者或多者：类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、韦氏肉芽肿病、系统性红斑狼疮、银屑病、肉状瘤病多关节幼年型特发性关节炎、炎症性肠病(诸如溃疡性肠炎和克罗恩氏病)、莱特尔综合征、纤维肌痛和1型糖尿病。在一个实施例中，自身免疫病并非同一组疾病中的任何一者。
[0115]
在一个实施例中，自身免疫病为银屑病关节炎。在一个实施例中，自身免疫病并非银屑病关节炎。
[0116]
在一个实施例中，自身免疫病为强直性脊柱炎。在一个实施例中，自身免疫病并非强直性脊柱炎。
[0117]
在一个实施例中，自身免疫病为多发性硬化。在一个实施例中，自身免疫病并非多发性硬化。
[0118]
在一个实施例中，自身免疫病为韦氏肉芽肿病。在一个实施例中，自身免疫病并非韦氏肉芽肿病。
[0119]
在一个实施例中，自身免疫病为系统性红斑狼疮。在一个实施例中，自身免疫病并非系统性红斑狼疮。
[0120]
在一个实施例中，自身免疫病为银屑病。在一个实施例中，自身免疫病并非银屑病。
[0121]
在一个实施例中，自身免疫病为肉状瘤病。在一个实施例中，自身免疫病并非肉状瘤病。
[0122]
在一个实施例中，自身免疫病为多关节幼年型特发性关节炎。在一个实施例中，自身免疫病并非多关节幼年型特发性关节炎
[0123]
在一个实施例中，自身免疫病为炎症性肠病(诸如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)。在一个实施例中，自身免疫病并非炎症性肠病(诸如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)。
[0124]
在一个实施例中，自身免疫病为莱特尔综合征。在一个实施例中，自身免疫病并非莱特尔综合征。
[0125]
在一个实施例中，自身免疫病为纤维肌痛。在一个实施例中，自身免疫病并非纤维肌痛。
[0126]
在一个实施例中，自身免疫病为1型糖尿病。在一个实施例中，自身免疫病并非1型糖尿病。
[0127]
在一个实施例中，自身免疫病为关节炎(诸如类风湿关节炎)。在一个实施例中，自身免疫病并非关节炎(诸如类风湿关节炎)。
[0128]
制剂
[0129]
dhodh抑制剂是抑制(例如，降低或阻断)dhodh酶(其定义见“

背景技术：
”)的活性的部分(诸如化合物)。
[0130]
在一个实施例中，dhodh抑制剂作为药物制剂提供。
[0131]
本发明的药物组合物可以通过任意数量的途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、透皮、经皮(例如，参见wo98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。
[0132]
在一个实施例中，药物制剂用于口服施用，例如配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆剂和混悬剂，供患者摄入。
[0133]
赋形剂可包括乳糖、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、淀粉、糖、糖醇和纤维素。
[0134]
其他合适的施用形式包括肠胃外施用，例如注射或输注，诸如推注或连续输注。
[0135]
在产品用于注射或输注的情况下，其可以呈油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，分子可以为干燥形式，以便在使用前用适当的无菌液体复溶。治疗组合物中的药用载体可另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质，诸如润湿剂、乳化剂、润滑剂或ph缓冲物质，可存在于此类组合物中。
[0136]
有关药用载体的全面讨论可参见remington
′
s pharmaceutical sciences(mack publishing company，n.j.1991)。
[0137]
治疗
[0138]
如本文所采用的治疗是指其中患者患有疾病或疾患，例如自身免疫病(特别是本文所公开的自身免疫病中的一种)，并且施用根据本公开的药物以稳定疾病、延缓疾病、改善疾病、使疾病缓解、维持疾病缓解状态或治愈疾病。如本文所采用的治疗包括施用根据本公开的药物用于治疗或预防。
[0139]
可预防性地采用治疗或疗法。
[0140]
如本文所采用的治疗有效量是在其产生所需的生理学效果的范围内同时使副作用最小化的量。
[0141]
如本文所采用的疾病修饰疗法(disease modifying therapy)是指使免疫系统自我重置并且重新平衡，从而在治疗后表现得更正常。
[0142]
本公开的dhodh抑制剂或包含其的制剂可以以如下范围内的剂量施用：每天1mg至400mg，诸如每天10mg至400mg、每天50mg至400mg、每天100mg至400mg、每天150mg至400mg、每天200mg至400mg、每天250mg至400mg、每天300mg至400mg或每天350mg至400mg。
[0143]
特别地，以每天100mg至400mg范围内的剂量施用。
[0144]
因此，日剂量可以为例如10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、
100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg、370mg、380mg、390mg或400mg。
[0145]
在一个实施例中，治疗每天施用，例如每天一次或两次施用。
[0146]
在一个实施例中，治疗每天一次。
[0147]
在一个实施例中，aslan003经口服施用，例如以片剂或胶囊剂或囊片的形式。
[0148]
如本文所采用的并存疾病是指其中患者患有第二种或潜在的健康状况。
[0149]
如本文所采用的组合疗法(包括另外的疗法)，其中采用、特别是同时采用两种或两种以上的治疗方案。治疗可以为单独制剂或共同配制。它们可以同时或在不同时间施用。但是，治疗的药理作用将在患者体内共存。
[0150]
如本文所采用的另外的疗法(further therapy)是指除dhodh抑制剂以外的疗法。
[0151]
此类另外的疗法可以为抗炎剂，其包括但不限于非甾体抗炎剂(nsaid)、疾病修饰抗风湿药(dmard)、他汀类药物(包括hmg-coa还原酶抑制剂，诸如辛伐他汀)、生物制剂(生物制品)、类固醇、免疫抑制剂、水杨酸盐和/或杀微生物剂。
[0152]
非甾体抗炎剂包括抗代谢剂(诸如甲氨蝶呤)和抗炎金剂(包括硫代苹果酸金钠、硫代苹果酸金或金盐，诸如金诺芬)。生物制品包括抗tnf剂(包括阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、抗il-1试剂、抗il-6试剂、抗cd20剂、抗b细胞试剂诸如利妥昔单抗)、抗t细胞试剂(抗cd4抗体)、抗il-15试剂、抗clta4试剂、抗rage试剂)、抗体、可溶性受体、受体结合蛋白、细胞因子结合蛋白、功能改变或减弱的突变蛋白、rnai、多核苷酸适体、反义寡核苷酸或ω3脂肪酸。类固醇(也称为皮质类固醇)包括可的松、泼尼松龙或地塞米松，也可以在组合疗法中采用。
[0153]
在根据本公开的组合疗法中使用的免疫抑制剂包括环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸酯。在所述组合疗法中使用的水杨酸盐包括阿司匹林、水杨酸钠、水杨酸胆碱和水杨酸镁。杀微生物剂包括奎宁和氯喹。
[0154]
如本文所采用的抗炎是指减少炎症、用于非甾体抗炎、类固醇等的部分。
[0155]
在一个实施例中，组合疗法包含抗cd20药剂或其生物仿制药，例如rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗生物仿制药、gazyva、kesimpta、ocrevus(奥瑞珠单抗)、ruxience、truxima、zevalin、arzerra、acellbia、hlx01、reditux、ritucad或zytux。
[0156]
在一个实施例中，组合疗法包含独立地选自以下项的治疗：皮质类固醇(例如口服泼尼松和静脉内甲泼尼龙)、血浆置换(血浆分离)、干扰素β药物、醋酸格拉替雷、芬戈莫德、富马酸二甲酯、富马酸地罗昔美、特立氟胺、西尼莫德、克拉屈滨、奥瑞珠单抗、那他珠单抗和阿仑单抗。
[0157]
在一个实施例中，组合疗法包含缓解或减轻多发性硬化症状的治疗，例如，肌肉松弛剂(诸如巴氯芬、替扎尼定和环苯扎林)、减轻疲乏的药物(诸如金刚烷胺、莫达非尼、哌甲酯或提高步行速度的药物(诸如达伐吡啶)。
[0158]
在一个实施例中，组合疗法包含大麻或其衍生物，例如大麻油。
[0159]
在一个实施例中，组合疗法包含第二dhodh抑制剂。在一个实施例中，另外的疗法包含特立氟胺。在一个实施例中，另外的疗法包含vidofludimus。在一个实施例中，组合疗法不包含第二dhodh抑制剂。在实施例中，组合疗法不包含特立氟胺和/或维多氟拉迪莫
(vidofludimus)。
[0160]
在一个实施例中，组合疗法包含疾病修饰疗法，例如选自阿仑单抗、avonex、倍泰龙(betaferon)、克拉屈滨、达利珠单抗、富马酸二甲酯、extavia、芬戈莫德、醋酸格拉替雷、那他珠单抗、奥瑞珠单抗、plegridy、rebif、西尼莫德和其两种或更多种的组合。
[0161]
在一个实施例中，另外的疗法包含干扰素β(ifn-β)，诸如干扰素β-1a或干扰素β-1b。因此，在一个实施例中，另外的疗法包含干扰素β-1a。在一个替代实施例中，另外的疗法包含干扰素β-1b。
[0162]
在一个实施例中，组合疗法包含布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂，例如依鲁替尼、阿可替尼、泽布替尼、埃沃布鲁替尼、abbv-105、非奈布替尼、gs-4059、司培替尼和/或hm71224。
[0163]
在一个实施例中，另外的疗法包含醋酸格拉替雷。在一个实施例中，另外的疗法包含那他珠单抗。在一个实施例中，另外的疗法包含米托蒽醌。在一个实施例中，另外的疗法包含芬戈莫德。在一个实施例中，另外的疗法包含西尼莫德。在一个实施例中，另外的疗法包含富马酸二甲酯。在一个实施例中，另外的疗法包含阿仑单抗。在一个实施例中，另外的疗法包含环磷酰胺。在一个实施例中，另外的疗法包含克拉屈滨。在一个实施例中，另外的疗法包含奥瑞珠单抗。在一个实施例中，另外的疗法包含富马酸二甲酯。在一个实施例中，另外的疗法包含达利珠单抗。在一个实施例中，另外的疗法包含硫唑嘌呤。在一个实施例中，另外的疗法包含甲氨蝶呤。在一个替代实施例中，另外的疗法不包含甲氨蝶呤。在一个实施例中，另外的疗法包含拉喹莫德(lacquinimod)。
[0164]
在本说明书的上下文中的“包含”旨在表示“包括”。
[0165]
在技术上适当的情况下，本发明的实施例可以组合。
[0166]
本文所述的实施例包括某些特征/要素。本公开还延伸到由所述特征/要素组成或基本上由其组成的单独实施例。
[0167]
技术参考文献诸如专利和申请通过引用并入本文。
[0168]
本文具体且明确叙述的任何实施例可以单独或与一个或多个另外的实施例组合形成免责声明的基础。
[0169]
本技术要求2020年10月15日提交的新加坡申请序列号10202010254q和2020年12月21日提交的10202012817s的优先权，两者均以引用方式并入本文。这些文件可用作更正的基础。
[0170]
背景技术包含技术信息，并可用作修改的基础。
[0171]
现在将参照以下实例描述本发明，这些实例仅为例示性的，不应解释为限制本公开的范围。
[0172]
实例
[0173]
实例1 aslan003在多发性硬化eae模型中的体内研究
[0174]
实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)是一种经过充分研究的脱髓鞘疾病诸如人多发性硬化(ms)的动物模型。eae通过向易感动物注射纯化的髓磷脂组分、中枢神经系统(cns)提取物或合成的在佐剂中乳化的特异性肽来诱导。这些肽例如来源于髓鞘碱性蛋白(mbp)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)或蛋白脂质蛋白(plp)。
[0175]
为研究aslan003对多发性硬化的效应，从疾病诱导后第8天开始，aslan003以1mg/
kg、3mg/kg、10mg/kg或15mg/kg的剂量口服施用于eae模型。包括媒介物对照。
[0176]
结果在图1中示出。从图中可以看出，与媒介物对照相比，aslan003(las186323)导致临床评分显著降低。此外，aslan003似乎以剂量依赖性方式阻止疾病进展。
[0177]
因此，这些数据为aslan003用于治疗自身免疫病(诸如多发性硬化)的潜力提供了有力的证据。
[0178]
实例2 aslan003在eae模型中与阳性对照t的体内研究比较
[0179]
1.实验方案
[0180]
1.1.eae的诱导和临床评分
[0181]
对于eae的诱导，使用以2mg/ml的浓度悬浮在0.9％盐水溶液中的豚鼠髓鞘碱性蛋白(mbp)(sigma，m2295)。将溶液用等体积的弗氏完全佐剂(sigma，f5881)乳化，该弗氏完全佐剂含有4mg/ml热灭活的结核分枝杆菌h37ra(difeo实验室，参考号231141)。通过将0.1ml乳剂皮下注射到左右后爪垫中，对雄性lewis大鼠进行免疫，该乳剂中含有100μg mbp/大鼠。
[0182]
每个eae实验(n＝5)中包括一组未诱导疾病的初治动物作为健康对照以用于比较目的。
[0183]
每天检查个体动物的神经功能缺损的临床症状，根据0至5分量表进行评分，如下所示：
[0184][0185]
表1-神经功能缺损评分系统
[0186]
在诱导后第8天至第9天观察疾病的临床体征。当约10％的动物显示出临床症状时，将它们随机分入不同的组(n＝7至8)并且开始治疗。
[0187]
随着疾病进展，如果残疾表明恢复机会很小，则根据动物福利标准，将评分为4分的动物处死。在给定日期，将由于处死或自发性eae相关死亡而导致的死亡记录为5分。该死亡评分继续纳入临床评定中，但体重测量结果无法延续。
[0188]
1.2.化合物
[0189]
每天新鲜制备las 186323(aslan003)、阳性对照t和阳性对照f，并且将其以指定
剂量悬浮于0.5％甲基纤维素和0.1％tween 80水溶液中，并且以10ml/kg的体积经口管饲施用。
[0190]
1.3.血液学细胞计数
[0191]
测定结束时，在最后一次施用后24h，在光麻醉下从所有动物身上获得来自眶后丛的血液样品。将样品用于确定全血细胞计数(xt-2000i/xt-1800i，sysmex corporation)。报告所有细胞类型的绝对值。
[0192]
1.4.cns的组织学
[0193]
实验结束时，通过放血杀死动物，并且在盲态下进行尸检。获得eae动物的脊髓(cns；脊髓、延髓、小脑)，固定于pbs中的4％福尔马林中，并且包埋在石蜡中。制备6μm厚的切片，然后用苏木精和伊红染色。组织学评分评估如下：
[0194]
0：无病灶；
[0195]
1：在整个切片中存在孤立病灶与低细胞密度的细胞浸润；
[0196]
2：在几个视野中的每一个中，存在几个病灶与中度细胞浸润；
[0197]
3：在几乎所有视野中均存在许多病灶与大量细胞浸润并且伴有水肿(kataoka，2005)。
[0198]
2.结果
[0199]
2.1.临床评分
[0200]
每天对残疾进行评估，并且对每只动物进行临床评分，如前所述。针对每只动物，根据在整个实验中记录的数据生成曲线下面积(auc)的临床评分。计算每只动物的auc与媒介物组auc平均值相比的抑制百分比。计算每种治疗和剂量的平均抑制百分比。
[0201]
图2示出各治疗组的临床评分auc的平均值；媒介物(v)和las186323(aslan003)(l)。缩写后面的数字对应于化合物施用的口服日剂量，单位为mg/kg。
[0202]
图4示出疾病随时间的演变。每个点代表该特定治疗日(x轴)的临床评分的平均值(y轴)。媒介物(v)、阳性对照(f)、阳性对照(t)和las186323(l)。缩写后面的数字对应于化合物施用的口服日剂量，单位为mg/kg。
[0203]
下表2示出临床评分的抑制百分比，该抑制百分比为临床疗效的量度。
[0204]
[0205][0206]
表2-临床评分的抑制百分比(％)
[0207]
尽管无法计算出阳性对照t的适当ed
50
，但已经计算出估计值1.5mg/kg。通过线性回归计算出的aslan003的ed
50
为2.7mg/kg/天。
[0208]
2.2.cns组织学评估
[0209]
图3示出cns组织学评分。观察到临床评分改善与组织学评分之间的对应关系。在阳性对照t和aslan003中均获得良好的剂量反应，观察到前一种化合物的斜率更陡。在测试的最高剂量下，与用媒介物治疗的动物相比，用阳性对照t或aslan003治疗的动物在显微镜下cns病灶方面显示出显著改善。
[0210]
2.3.血液学细胞计数
[0211]
在最后一次施用后24小时采集血液样品，并且如上所述进行血液学细胞计数。图5示出每个治疗组的绝对细胞计数
×
103/μl。由于其作用机制，观察到的阳性对照f对总淋巴细胞计数的显著影响符合预期。在用10mg/kg的阳性对照t以及3mg/kg和15mg/kg的aslan003治疗的动物中观察到中性粒细胞数量减少，但在用10mg/kg的aslan003治疗的动物中未观察到。但是，与媒介物相比，未观察到统计学显著差异。在阳性对照t中观察到红细胞计数(rbc)的轻度剂量反应。
[0212]
3.结论
[0213]
基于上述结果，在eae lewis大鼠模型中，当aslan003通过口服途径向患有既有疾病的动物每天施用一次时，其似乎以剂量依赖性方式抑制疾病进展。外部神经系统症状的改善对应于cns细观损伤的减少。用aslan003治疗对血细胞计数无显著影响。
[0214]
实例3-aslan003与阳性对照t相比在类风湿关节炎(ra)aia模型中的体内研究
[0215]
佐剂性关节炎(aia)是通过足底注射完全弗氏佐剂(cfa)诱导大鼠类风湿关节炎(ra)的实验模型。疾病进展为在接受注射的爪子上的严重炎症。cfa所致全身性炎症和免疫改变转化为诱导后第7天至第10天对侧爪的炎症。
[0216]
aia模型在临床上预测疗效的能力是公认的。
[0217]
因此，为研究aslan003对ra的效应，将aslan003施用于aia大鼠模型。
[0218]
1.实验方案
[0219]
1.1.供试化合物
[0220]
每天新鲜制备指定剂量的作为在0.5％甲基纤维素和0.1％tween 80水溶液中的悬浮液的aslan003，并且以10ml/kg的体积经口管饲施用。
[0221]
1.2动物
[0222]
使用体重为175至200g的雄性wistar大鼠。
[0223]
1.3关节炎诱导
[0224]
通过加入15ml石蜡油(merck，#7162)和几滴蒸馏水来制备75mg结核分枝杆菌h37 ra(difco，#231141)干燥提取物的悬浮液。cfa中分枝杆菌的浓度为5mg/ml。将悬浮液超声
处理10分钟，并且在整个过程期间保持在摇床中。将大鼠麻醉并且将0.1ml cfa悬浮液通过足底注射到它们的左后爪中。
[0225]
在疾病诱导10天后，通过器官充满度测量法(ugo basile，#7140)测量每只大鼠后爪的炎症。炎症以ml表示。在第1天，即施用第一天，将两只爪子体积相似的大鼠(n＝6至7)分配到治疗组中。
[0226]
每天早上向大鼠施用cfa，连续10天。每天测量体重，并且每隔一天测量爪子体积。在治疗后第11天(最后一次施用后24小时)，将大鼠麻醉，从其眶后丛采集血液样品以确定细胞计数，然后将其处死。切除后爪进行x线分析，并且由一名不知情的科学家在盲态下进行放射学损伤评分。
[0227]
放射学评分是根据每只爪子的x线图像评估的5个不同参数的综合。这5个参数是：骨脱矿质、骨膜炎、关节间隙狭窄、囊性变性和软组织炎症。对于每个参数，分配0至4的值，该值与观察到的严重程度成比例。这5个参数的分数之和提供每只动物的放射学评分。
[0228]
1.4计算
[0229]
对于每只动物，炎症作为右爪体积的曲线下面积(auc)进行测量。auc通过对爪子炎症(以ml为单位)与时间(以天为单位)作图来计算。还获得媒介物治疗组的平均值。
[0230]
治疗功效作为每只动物相比于媒介物的平均值的抑制百分比来计算。计算每个治疗组的平均值。在对给定化合物和剂量进行多于一次实验的情况下，计算平均值
±
平均值的标准误差(sem)。
[0231]
通过计算属于治疗组的每只动物的放射学评分与媒介物治疗组的平均值相比的抑制百分比来测量治疗对放射学评分抑制的影响。在其中进行多次实验的情况下，提供的值为单个实验的平均值和sem。
[0232]
2.结果
[0233]
图6示出爪子炎症的auc，并且下表3示出auc的数值以及auc的抑制百分比，其表示为来自2至5次独立实验的平均值
±
sem值。
[0234][0235]
单向anova与bonferroni后检验，*p＜0.05(与媒介物相比)
[0236]
表3-aslan003在aia模型中的auc和抑制百分比(％)
[0237]
与媒介物治疗的大鼠相比，3mg/kg和10mg/kg aslan003显著减少了右爪肿胀。在用10mg/kg阳性对照t和aslan003治疗的组中，auc值最低，表明抗炎效应较高。
[0238]
使用来自2至5次独立实验的爪子体积的平均减少百分比计算出aslan003的ed
50
值为4.6mg/kg。
[0239]
下表4示出不同治疗组中的白细胞(wbc)和血小板计数。不同治疗组之间血细胞计数的比较表明，关节炎的诱导导致wbc和血小板两者显著增加(媒介物与初治大鼠相比)。在用3mg/kg阳性对照tat或10mg/kg aslan003治疗的关节炎大鼠中，观察到wbc数量与媒介物
相比显著减少。在相同剂量下，与用媒介物治疗的大鼠相比，aslan003还显著降低了血小板数量。
[0240][0241]
#p＜0.05(与初始动物相比)，*p＜0.05(与媒介物相比)
[0242]
表4-aia模型中的wbc和血小板计数
[0243]
用最高剂量(3mg/kg和10mg/kg)的aslan003或阳性对照t治疗的关节炎大鼠爪子的放射学评分如图7所示。数值显示在下表5中。结果表示为2至3次独立实验的平均值
±
sem。
[0244][0245]
表5-aia模型中的x线检查评分
[0246]
结果表明，虽然3mg/kg阳性对照t和10mg/kg aslan003两者的平均评分均低于用媒介物治疗的大鼠的平均评分，但差异无统计学意义。
[0247]
3.结论
[0248]
aslan003每天口服施用一次，在患有既有关节炎的大鼠的爪子中显示出抗炎效应。还观察到外周血中wbc和血小板数量的剂量依赖性减少，其在测试的最高剂量下达到统计学意义。aslan003改善了爪子的放射学评分，表明其具有疾病修饰潜力。
[0249]
总之，本研究证明了aslan003作为用于ra的有效治疗的潜力。
[0250]
实例4-aslan003与阳性对照v相比在葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的炎症性肠病(ibd)小鼠模型中的体内研究
[0251]
1.实验方案
[0252]
1.1动物
[0253]
6至7周龄雄性c57bl/6小鼠购自中国上海灵畅生物科技有限公司。
[0254]
1.2治疗计划、样品采集及参数
[0255]
将动物根据体重随机分入以下组：
[0256]
组01：纯化水，随意，第1天至第8天；媒介物，5ml/kg，po，qd，第0天至第9天，n＝6
[0257]
组02：3％dss水溶液，随意，第1天至第8天；媒介物，5ml/kg，po，qd，第0天至第9天，n＝8
[0258]
组03：3％dss水溶液，随意，第1天至第8天；阳性对照v，20mg/kg，po，qd，第0天至第9天，n＝8
[0259]
组04：3％dss水溶液，随意，第1天至第8天；aslan003，低剂量，po，qd，第0天至第9天，n＝8a
[0260]
组05：3％dss水溶液，随意，第1天至第8天；aslan003，高剂量，po，qd，第0天至第9天，n＝8
[0261]
缩略语：qd＝每天一次；po＝经口管饲。
[0262]
研究持续时间：3周的适应期，以及从第0天开始的10天治疗期(第0天至第10天)。
[0263]
结肠炎模型诱导：为诱导急性实验性结肠炎，向组02至05小鼠提供3％dss在纯化水中的溶液持续7天(第1天至第7天)，然后提供纯化水持续2天(第9天至第10天)。含有dss的饮用水每两天更换一次。在第1天至第7天期间，为组01中的小鼠提供纯化水以作为对照。
[0264]
测量的活体参数：
[0265]
·
在第0天至第10天期间，每天监测一次水和食物消耗量。
[0266]
·
在第0天至第10天期间，每天测量一次体重，每天进行两次临床监测。
[0267]
·
在第0天至第10天期间，每天进行一次粪便观察。确定疾病活动指数(dai)以量化结肠炎的诱导。
[0268]
·
在第0天和第9天评定肠道通透性。
[0269]
·
在第0天、第4天、第8天和第10天采集粪便进行脂质运载蛋白-2检测。
[0270]
研究终止：在第10天处死小鼠，并且对处死的动物进行以下处理：
[0271]
采集血液
[0272]
·
将小鼠放血以制备血清，并且储存于-60℃至-80℃，用于潜在细胞因子测定。
[0273]
采集结肠
[0274]
·
采集整个结肠(从盲肠到肛门)，并且测量其从回盲瓣到肛门的长度。
[0275]
·
为每只小鼠拍摄一张整个结肠的照片。
[0276]
·
沿肠系膜边界打开结肠，用盐水冲洗，吸干并且测量其重量。
[0277]
·
将结肠处理为“螺旋瑞士卷”(spiral swiss rolls)，固定在10％中性缓冲福尔马林中24至48小时，并且包埋在石蜡(每只小鼠一个块)中，用于苏木精-伊红(h&e)染色和组织病理学评估。
[0278]
脾脏重量
[0279]
·
解剖脾脏，测量其组织重量并且记录，然后丢弃。
[0280]
2.结果
[0281]
研究的结果显示在图8至13中。
[0282]
图8a和8b示出研究过程中动物的体重测量结果。dss诱导的媒介物组2和两个aslan003治疗组(组4和5)的体重减轻相似，而阳性对照v治疗组3的体重减轻最严重。
[0283]
图9a和9b示出研究过程中动物的粪便评分。图9a中的粪便硬度评分越高，指示粪便硬度越低，而图9b中的血便评分越高，指示观察到的血便越多。
[0284]
从图中可以看出，在研究的早期阶段，与其他dss诱导的动物相比，阳性对照v治疗组3的总体粪便硬度较低，最终在第10天达到最佳粪便硬度。aslan00375mg/kg组5在第2天至第9天具有最佳总体粪便硬度，然后在第10天以与媒介物组2和aslan00325mg/kg组4相似
的粪便硬度评分结束研究。
[0285]
在血便方面，结果表明，aslan00375mg/kg治疗组5在研究过程中的血便发生率最低。有趣的是，阳性对照v治疗组3的血便发生率最高，似乎甚至超过了媒介物治疗组2的血便发生率。
[0286]
图10示出研究过程中动物的疾病活动指数(dai)。dai是一种用于评定患者结肠炎的评分机制，是基于体重减轻、粪便硬度和出血的综合评分。结果表明，阳性对照v治疗组3的dai增加最多，最终在研究第10天下降到与媒介物组2和aslan00325mg/kg组4相似的水平。此外，结果似乎表明，与所有其他治疗组相比，aslan00375mg/kg组5在10天内的dai的总体增加较低，并且在第10天具有较低的dai评分。
[0287]
图11示出研究第0天和第9天动物的肠道通透性(fitc-葡聚糖浓度)结果。aslan00325mg/kg治疗组4和媒介物组2似乎在第9天具有相似的fitc-葡聚糖浓度测量结果。令人惊讶的是，阳性对照v治疗组3在第9天的测量结果明显高于所有其他治疗组，表明与对照组1相比，该组动物的肠道通透性显著改变。
[0288]
图12示出研究结束时不同治疗组的结肠和脾脏测量结果。当如图12c所示同时考虑结肠重量和长度时，结果似乎表明媒介物组2与aslan003治疗组4和5的结肠/长度测量结果非常相似。阳性对照v治疗组3的结肠/长度测量结果与对照组1更相似。
[0289]
图12d似乎表明aslan00375mg/kg治疗组5的脾脏重量与对照组1最相似，其他治疗组的脾脏重量彼此相似。
[0290]
图13示出研究过程中动物粪便中的脂质运载蛋白数据。脂质运载蛋白是肠道炎症的敏感的非侵入性生物标志物。结果表明，aslan003治疗组4和5具有小于媒介物治疗组2的肠道炎症。相反，与媒介物治疗组2相比，阳性对照v治疗组3似乎表现出更大程度的肠道炎症。
[0291]
总之，结果表明：
[0292]
1.与dss诱导的媒介物组2相比，aslan003治疗组4和5的dai、粪便硬度、血便和粪便中的脂质运载蛋白有所改善。
[0293]
2.特别地，与其他dss诱导组相比，aslan00375mg/kg治疗组5具有最低dai总体增加、最佳总体粪便硬度、最低血便发生率和最低粪便中脂质运载蛋白。该治疗组还具有与对照组1最相似的脾脏重量。
[0294]
3.与其他dss诱导组相比，阳性对照v组3具有最大体重减轻、最大dai总体增加、最低总体粪便硬度、最高血便发生率、最高肠道通透性和最高粪便中脂质运载蛋白。该治疗组还具有与对照组1最相似的结肠/长度测量结果。
[0295]
这些结果证明，与对照组相比，用aslan003治疗的动物在一系列不同参数上均得到改善，表明aslan003在用于治疗炎症性肠病方面具有强大的潜力。结果还表明，与对照组相比，使用aslan003(特别是在较高的75m/kg浓度下)使动物获得更大幅度的改善。出乎意料的是，结果进一步表明，与媒介物组2相比，用阳性对照v治疗的动物在测试的一些参数上具有不太理想的结果。