一种突变型Taq酶及其制备方法与流程

一种突变型taq酶及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种突变型taq酶及其制备方法。


背景技术：

2.1969年，美国印第安那大学的微生物学家thomas brock和他的研究生hudson freeze从黄石国家森林公园火山温泉中发现了一种嗜热型海栖热袍菌t.aquaticus(taq)。1976年trela和他的华裔研究生钱嘉韵alice chien分离纯化得到了taq dna聚合酶。后来测得它的分子量65kd，全长2496个碱基,编码832个氨基酸。1986年6月，mullis的同事saiki首次将纯化的taq酶应用在pcr中，从此，开始了pcr质的飞跃，taq dna聚合酶大放异彩是在pcr反应中的应用。
3.随着pcr应用越来越多样化，实验要求的提升和生物样本复杂性的提高，“野生型”taq酶的缺点也逐渐凸显出来，如扩增效率低、特异性差、高at或gc含量样本扩增结果差、样本中或pcr系统中的有些抑制剂对反应有干扰等等，导致酶活性低、耐热性差的问题，远远不能满足人们的需求。因此需要对现有taq进行进一步的改造来改善taq dna聚合酶的酶活性和耐热性等。科研人员利用大肠杆菌可以任意突变，改造，然后通过扩增、酶切、连接、表达、提纯等步骤进行一次又一次的改造和筛选来生产要求更高的taq酶来适应更为广泛的工业生产以及科研应用。


技术实现要素：

4.发明目的：
5.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种突变型taq酶及其制备方法。
6.技术方案：
7.本发明的第一方面，提供了一种突变型taq酶，所述突变型taq酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明的第二方面，提供了一种核酸，所述核酸编码本发明的第一方面所述的突变型taq酶，所述的核酸具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。
9.本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第二方面所述的核酸。
10.进一步的，所述的宿主细胞选自大肠杆菌dh5α感受态细胞。
11.本发明的第四方面，提供了如第一方面所述突变型taq酶的制备方法，其特征在于，将市售taq酶基因的质粒定点突变，市售taq酶基因的氨基酸序列为seq id no.3，核苷酸序列为seq id no.4，得到如第二方面中核苷酸序列为seq id no.2的taq酶质粒，将taq酶质粒转化到感受态细胞中，从培养的细胞中分离纯化获得突变型taq酶。
12.本发明的第五方面，提供了所述突变型taq酶在扩增dna样本中的应用。
13.本发明的第六方面，提供了一种pcr扩增试剂盒，含有如第一方面所述突变型taq酶。
14.有益效果：
15.本发明通过突变氨基酸位点q592k、s612r、a643l、v649l、a689i、f697i、和v720i，得到突变型taq酶，在相同条件下的检测中突变型taq酶的活性较市售taq酶的活性有明显的提高，同时在热稳定性方面，突变型taq酶较市售taq酶有明显改善。
附图说明
16.图1为突变型taq酶与市售taq酶的sds-page图；
17.图2为突变型taq酶和市售taq酶的活性检测结果图(2a为突变型taq酶的活性检测结果，2b为市售taq酶的活性检测结果)；
18.图3为热稳定性检测结果图(3a1，3a2为突变型taq酶存放0天和30天后在同一浓度模板下检测得到的一组曲线，3a1为突变型0天，3a2为突变型30天；3b1，3b2为市售taq酶在存放0天和30天后在同浓度模板下检测得到的一组曲线，3b2为市售taq酶0天，3b1为市售taq酶30天)。
具体实施方式
19.为了更好的解释本发明，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
20.本发明公开了一种突变型taq酶，还公开该酶的制备方法。本发明采用现代基因工程技术，将市售taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行突变。
21.实施例1：taq酶质粒的定点突变
22.将含有市售taq酶基因(氨基酸seq id no.3，核苷酸序列seq idno.4，genbank:mg727867.1)的质粒，进行pcr扩增。合成的扩增引物即突变引物，包含了需要突变的位点，且已经替换了所需要突变的碱基。pcr扩增后，利用酶消化原来的母板，后将pcr的产物即含有突变后的taq酶基因的质粒转化到感受态细胞中。挑选克隆即可得到含突变型酶基因的质粒。进行测序验证，基因测序得到的核苷酸序列如seq idno.2，证明突变后的taq酶与设计的突变序列一致。
23.pcr扩增过程：
24.50μl反应体系：10
×
buffer(100mmol/l kc1,100mmol/l(nh4)2so4，200mmol/l tris-hcl ph8.8，20mmol/l mgso4，2％甘油)5μl，10mmol/l dntp 0.5μl，突变引物各125ng，lu pfu酶，含50ng质粒模板1μl，加ddh20至50μl。
25.反应条件：94℃变性1分钟30s，循环周期为94℃20秒，60℃20秒，72℃15min，30个循环。pcr反应结束后将反应管放在冰盒上4℃降温。然后加入1μl的限制性内切酶hind iii(5'-a
↓
agctt-3')放置在37℃的恒温箱中酶解70min，消化掉未能突变的模板，最后将消化后的pcr产物转化到dh5α感受态细胞中。引物设计规则:引物中必须包含突变的位点，其它序列和原基因序列完全互补，且设计时引物长度控制在20-45bp，尽量使得退火温度≥78℃。使得引物可以很好的和taq酶基因结合，并且可以大幅降低引物多聚体的形成。
26.突变引物序列为：
27.taq-f：ccaccccatcgtggagaagat(seq id no.5)，
28.taq-r：ggttgggatcggagctactt(seq id no.6)。
page图中可知，突变型taq酶与市售taq酶条带大小一致，无肉眼可视杂带。
47.实施例4突变型taq酶与市售taq酶的酶活性比较
48.将已标定的突变型taq酶和市售taq酶用荧光定量pcr方法进行酶活比较，将市售taq酶和突变型taq酶同一实验条件下进行检测对比。反应体系：
49.组分名称体积(μl)扩增预混液10primer f(10μm)0.5primer r(10μm)0.5模板dna1-9depc水to 20
50.反应程序：
[0051][0052]
实验结果：请参考图2，图2a为突变型taq酶的活性检测结果，图2b为市售taq酶的活性检测结果。图中每条曲线代表一个pcr反应，图中的横坐标表示pcr的循环次数，纵坐标表示荧光值。其中，图2a为突变型taq酶一组曲线，2b为市售taq酶的一组曲线：在检测中2a组与2b组曲线存在明显的差异，2a组曲线的高度明显高于2b组曲线，2a的ct值也低于2b，即突变型taq酶的扩增效率远大于市售taq酶。
[0053]
由此可得，在相同条件下的检测中突变型taq酶的活性较市售taq酶的活性有明显的提高。
[0054]
实施例4突变型taq酶与市售taq酶的热稳定性比较
[0055]
将突变型taq酶和市售taq酶在室温条件下存放0和30天后进行检测，本例中，存放0天和30天后分别将两种酶在同一浓度模板下进行检测：反应体系：
[0056]
组分名称体积(μl)扩增预混液10primer f(10μm)0.5primer r(10μm)0.5模板dna1-9depc水to 20
[0057]
反应程序：
[0058][0059]
实验结果：请参考图3，其中，图3a为荧光定量pcr检测突变型taq酶的热稳定性检测结果，图3b为荧光定量pcr检测市售taq酶的热稳定性检测结果。
[0060]
图中每条曲线代表一个pcr反应，图中的横坐标表示pcr的循环次数，纵坐标表示荧光值。其中，图3a1，3a2为突变型taq酶存放0天和30天后在同一浓度模板下检测得到的一组曲线，3a1为突变型0天，3a2为市售taq酶30天。3b1，3b2为突变型taq酶在存放0天和30天后在同浓度模板下检测得到的一组曲线图3b2为市售taq酶0天，3b1为市售taq酶30天。
[0061]
在检测中同等浓度模板时，3a1组与3a2组曲线的高度相差不大，即该条件下突变型taq酶稳定性较好，同时在热稳定性方面，突变型taq酶较市售taq酶有明显改善。