基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台及其制备方法、应用与流程

1.本发明涉及功能性纳米材料制备技术领域，尤其涉及的是一种基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台及其制备方法、应用。


背景技术：

2.由cas9核酸酶和单一引导rna(sgrna)组成的簇规则间隔短回文重复序列(crispr)相关蛋白9(cas9)系统，正通过靶基因的转化基因组编辑，成为一种前所未有的治疗各种疾病的技术。crispr-cas9系统通过靶向致瘤或抗肿瘤基因而被广泛应用于癌症治疗领域，其中，通过crispr基因组编辑直接抑制肿瘤细胞pd-l1的表达，具有特异性高、疗效持久等优点，在癌症免疫治疗中具有广阔的应用前景。尽管取得了显著进展，但免疫检查点阻断(icb)的应答率因肿瘤类型而异，而且crispr的靶向效率较低，导致临床试验的治疗效率不令人满意。
3.由于其非侵入性和时空可控的特点，光疗是一种很有前途的方案，利用光产生局部活性氧(ros)，并通过特异性近红外(nir)光反应光敏剂(ps)进行热疗，在肿瘤治疗领域受到了热烈的追求，即分别为光动力疗法(pdt)和光热疗法(ptt)。除了通过ros或热疗直接杀死恶性细胞外，光疗也被认为是诱导免疫原性细胞死亡(icd)的一种有利方式，这将通过释放肿瘤相关抗原(taas)作为免疫刺激的“危险”信号来重塑肿瘤微环境。此外，肿瘤的光疗激活还负面上调了pd-l1的表达水平，这很好地解释了肿瘤细胞的免疫调节机制。
4.因此，现有技术存在缺陷，有待改进与发展。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台及其制备方法、应用，旨在通过提供一种基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，实现优异的癌症治疗结果。
6.本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：
7.第一方面，一种基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，其中，包括：
8.复合物，所述复合物包括：cas9蛋白内核，吸附在所述cas9蛋白内核的褶皱间隙中的光敏剂以及吸附在所述cas9蛋白内核表面的用于靶向pd-l1的sgrna质粒；
9.阳离子聚合物膜，所述阳离子聚合物膜覆盖在所述复合物的表面；
10.阴离子聚合物膜，所述阴离子聚合物膜覆盖所述阳离子聚合物膜的表面。
11.本发明中，通过层层吸附过程制备了一个用于有效癌症治疗的多功能纳米平台，称为tcph。将典型的aiegens，封装到cas9蛋白的褶皱间隙中，通过rim效应放大荧光发射。与设计用于靶向pd-l1的sgrna质粒一起形成复合物，所述复合物被阳离子聚合物覆盖，其赋予递送系统溶酶体逃逸的功能，并通过cas9蛋白的核定位序列(nls)促进随后的核转运。阴离子聚合物，可以为血液循环提供带负电荷的表面，并靶向细胞表面分化簇44(cd44)受
体，在各种肿瘤细胞中高度表达，以提高肿瘤靶向效率。同时，crispr-cas9技术下调pd-l1的表达恢复了t细胞的抗肿瘤活性，然后通过抑制肿瘤细胞的生长。另一方面，光敏剂分子在光疗中发挥着关键作用，在近红外激光照射下提供足够的ros/热量和优异的成像性能。同时，温和的温度升高在阻碍肿瘤热阻效应、将冷肿瘤转化为热肿瘤，以换取免疫治疗结果的改善。
12.以下作为本发明的优选技术方案，但不作为对本发明提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本发明的目的和有益效果。
13.作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，其中，所述光敏剂为带正电荷的聚集诱导发光小分子有机物。
14.作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，其中，所述阳离子聚合物膜的材质为聚乙烯亚胺或其改性物。
15.作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，其中，所述阴离子聚合物膜的材质为透明质酸(ha)、聚谷氨酸或聚丙烯酸。
16.作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，其中，所述聚集诱导发光小分子有机物选自：
[0017][0018]
中的任一种。
[0019]
已经证明ttt的第二近红外光学窗口(nir-ii，1000-1350nm)荧光具有额外的优点，如减少光子散射、低组织背景和更深的组织穿透。因此，多模式成像(fli/pai/pti)引导的协同光疗-免疫治疗在各种模型中实现了有效的癌症光疗，这为临床应用带来了巨大潜力。
[0020]
第二方面，一种上述所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台的制备方法，其中，包括：
[0021]
将光敏剂溶液加入到cas9蛋白溶液中，得到混合物；
[0022]
对所述混合物进行涡旋处理，得到透明溶液；
[0023]
向所述透明溶液中加入用于靶向pd-l1的sgrna质粒，预定时间后，依次加入阳离子聚合物水溶液、阴离子聚合物水溶液，经超滤处理，得到基于聚集诱导发光和基因编辑的
多功能纳米平台。
[0024]
本发明中，采用吸附方式，将光敏剂、质粒、阳离子聚合物膜、阴离子聚合物膜层层吸附在cas9蛋白的表面，制备得到多功能纳米平台，该平台具有高靶向效率、在近红外激光照射下提供足够的ros/热量和优异的成像性能。该制备方法不涉及复杂的化学反应、严苛的反应条件。该制备方法具有操作简便、产品得率高的优点。
[0025]
作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台的制备方法，其中，所述光敏剂溶液的浓度为0.5-2mg/ml；所述cas9蛋白溶液的浓度为800-900μg/ml；所述阳离子聚合物水溶液的浓度为0.8-1.5mg/ml，阴离子聚合物水溶液的浓度为0.8-1.5mg/ml。
[0026]
作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台的制备方法，其中，所述用于靶向pd-l1的sgrna质粒的浓度为0.5-1.5mg/ml；所述阳离子聚合物水溶液的浓度为0.8-1.5mg/ml，阴离子聚合物水溶液的浓度为0.8-1.5mg/ml。
[0027]
作为优选的技术方案，所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台的制备方法，其中，所述预定时间为8-15min。
[0028]
第三方面，一种上述所述的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
[0029]
有益效果：本发明所提供的一种基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台，通过将典型的aiegens，封装到cas9蛋白的褶皱间隙中，通过rim效应放大荧光发射。与设计用于靶向pd-l1的sgrna质粒一起，复合物被阳离子聚合物覆盖，其赋予递送系统溶酶体逃逸的功能，并通过cas9蛋白的核定位序列(nls)促进随后的核转运。阴离子聚合物，可以为血液循环提供带负电荷的表面，并靶向细胞表面分化簇44(cd44)受体，在各种肿瘤细胞中高度表达，以提高肿瘤靶向效率。同时，crispr-cas9技术下调pd-l1的表达恢复了t细胞的抗肿瘤活性，然后通过抑制肿瘤细胞的生长。另一方面，光敏剂分子在光疗中发挥着关键作用，在近红外激光照射下提供足够的ros/热量和优异的成像性能。同时，温和的温度升高在阻碍肿瘤热阻效应、将冷肿瘤转化为热肿瘤，以换取免疫治疗结果的改善。
附图说明
[0030]
图1是本发明中基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台的制备流程示意图；
[0031]
图2是本发明中光敏剂(虚线)和tcph(实线)的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱图；
[0032]
图3为tcph和ce6分别在660nm激光照射下的活性氧产生能力；
[0033]
图4为4t1细胞在不同样品在不同条件下的存活率；
[0034]
图5为小鼠肿瘤位置nir-i荧光成像；
[0035]
图6为小鼠肿瘤位置nir-ii荧光成像；
[0036]
图7为各组小鼠肿瘤生长抑制率图。
具体实施方式
[0037]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用
于限定本发明。
[0038]
实施例1
[0039]
将1μl ttt-1(在二甲基亚砜中为1mg/ml)加入11.4μl cas9(875μg/ml)中。将混合物溶液涡旋10秒以获得透明溶液。然后向上述溶液中加入5μl质粒(1mg/ml)。10分钟后，依次加入0.1μl pei(1mg/ml水溶液)和0.1μl ha(1mg/ml水溶液)。经过低速超滤，得到一定浓度的tcph溶液。
[0040]
实施例2
[0041]
将1μl ttt-2(在二甲基亚砜中为0.5mg/ml)加入12μl cas9(800μg/ml)中。将混合物溶液涡旋8秒以获得透明溶液。然后向上述溶液中加入8μl质粒(0.5mg/ml)。10分钟后，依次加入0.5μl pei(0.8mg/ml水溶液)和0.4μl ha(0.8mg/ml水溶液)。经过低速超滤，得到一定浓度的tcph溶液。
[0042]
实施例3
[0043]
将1μl ttt-2(在二甲基亚砜中为0.5mg/ml)加入12μl cas9(800μg/ml)中。将混合物溶液涡旋8秒以获得透明溶液。然后向上述溶液中加入8μl质粒(0.5mg/ml)。10分钟后，依次加入0.5μl pei(0.8mg/ml水溶液)和0.4μl ha(0.8mg/ml水溶液)。经过低速超滤，得到一定浓度的tcph溶液。
[0044]
实施例4
[0045]
将1μl ttt-3(在二甲基亚砜中为0.5mg/ml)加入12μl cas9(800μg/ml)中。将混合物溶液涡旋8秒以获得透明溶液。然后向上述溶液中加入8μl质粒(0.5mg/ml)。10分钟后，依次加入0.5μl pei(0.8mg/ml水溶液)和0.4μl ha(0.8mg/ml水溶液)。经过低速超滤，得到一定浓度的tcph溶液。
[0046]
实施例5
[0047]
将1μl ttt-4(在二甲基亚砜中为0.5mg/ml)加入12μl cas9(800μg/ml)中。将混合物溶液涡旋8秒以获得透明溶液。然后向上述溶液中加入8μl质粒(0.5mg/ml)。10分钟后，依次加入0.5μl pei(0.8mg/ml水溶液)和0.4μl ha(0.8mg/ml水溶液)。经过低速超滤，得到一定浓度的tcph溶液。
[0048]
实施例6
[0049]
将0.6μl ttt-1(在二甲基亚砜中为2mg/ml)加入10μl cas9(900μg/ml)中。将混合物溶液涡旋10秒以获得透明溶液。然后向上述溶液中加入1μl质粒(1.5mg/ml)。10分钟后，依次加入1μl pei(1.5mg/ml水溶液)和0.8μl ha(1.5mg/ml水溶液)。经过低速超滤，得到一定浓度的tcph溶液。
[0050]
对实施例1所用的ttt-1分子以及制备的tcph纳米粒子进行紫外-可见吸收光谱和荧光光谱的测定，如图2所示。
[0051]
使用dchf-da作为指示剂对tcph的活性氧产生能力进行评估。0.5ml的dcfh-da(1
×
10-3
m)乙醇溶液加入到2ml naoh(1
×
10-2
m)溶液中进行活化得到dcfh，加入10ml pbs(ph 7.4)调节溶液酸碱度，避光放置。使用dcfh(5μm)在pbs(ph 7.4)溶液中对tcph和ce6(0.2μm)进行活性氧产生能力评估，分别使用660nm激光进行照射，使用荧光分光光度计记录488nm激发下不同时间点的525nm处的荧光强度，得到其荧光增强倍数。如图3所示，660nm激光的照射下tcph的ros产生能力很强。
[0052]
诊疗剂对乳腺癌细胞4t1细胞的光治疗抗增殖实验
[0053]
受试细胞：乳腺癌细胞4t1细胞；受试药物：化合物tcph；光源：660nm激光器
[0054]
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，随之将其以5
×
103个/孔的密度接种于96孔板，置于37℃，5％co2培养箱培养，24h后加入不同浓度的tcph nps，使得终浓度分别为0.5,1,2,3,4和5μm的样品，培养12h，然后光照(功率0.3w/cm2的660nm激光5分钟)，与此同时，处于相同实验条件下不进行光照的实验组也进行暗毒性研究。再培养12h后，使用pbs溶液洗3次，接着用新鲜的含10％cck-8
无fbs的培养基在黑暗条件下培养2h，然后用酶标仪测试450nm处的吸光度值(od值)，相应的细胞存活率计算是通过以下公式：细胞存活率(％)＝(od样品-od背景)/(od对照-od背景)
×
100％。实验结果见图4，在药物浓度为100μg/ml时，未受激光照射的对照组，细胞存活率超过95％，证明该化合物的暗毒性较小，生物相容性较好。tcph nps在激光照射，细胞存活率几乎为零，证明tcph对乳腺癌细胞4t1细胞具有明显的光治疗抗增殖作用。
[0055]
诊疗剂在4t1肿瘤小鼠体内的荧光成像实验
[0056]
用2％异氟醚2l/min的氧流量对移植瘤4t1小鼠进行麻醉，然后在瘤内注射tcph纳米颗粒(20μl,1mm)。使用ivis光谱成像系统(perkinelmer)和商用系列ii 900/1700成像系统，在注射后预定的时间间隔(1、6、24、48、72和96小时)获得体内近红外一区荧光成像，如图5所示。
[0057]
用2％异氟醚2l/min的氧流量对移植瘤4t1小鼠进行麻醉，然后在瘤内注射tcph纳米颗粒(20μl,1mm)。使用mars(artemis intelligent imaging,shanghai,china)成像系统，在注射后预定的时间间隔(1、6、24、48、72和96小时)获得体内近红外二区荧光成像，如图6所示。
[0058]
诊疗剂对4t1肿瘤小鼠体内的光治疗抗增殖实验
[0059]
移植瘤4t1肿瘤小鼠被随机分为6组(每组5只小鼠，包括生理盐水组、ttt nps组、tcph nps组、ttt

激光组和tcph 激光组)，当肿瘤体积达到100mm3后，通过瘤内注射打入20μl的tcph生理盐水溶液。24h瘤内注射后，各组小鼠肿瘤连续用660nm激光(0.3w/cm2)照射10min进行治疗。在各种治疗后，每三天记录每只小鼠的肿瘤大小和体重。用游标卡尺测量肿瘤体积，按常用公式v＝(肿瘤长度
×
肿瘤宽度2)/2计算。相对体积v/v0(v0为治疗前肿瘤初始体积)反映相对肿瘤生长比。实验结果见图7所示，tcph nps

激光组的组肿瘤生长抑制率最大，肿瘤几乎完全消除。由此可以看出，本发明提供的基于聚集诱导发光和基因编辑的多功能纳米平台制备的药物可以起到抗肿瘤的效果。
[0060]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。