一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法
技术领域：
：1.本发明属于食品安全检测和医学检验领域，具体涉及一种在纳米粒子表面定向偶联重组蛋白a进而定向偶联抗体的双重定向偶联免疫探针的制备方法。
背景技术：
：：2.蛋白a(proteina，pa)是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能够特异性地结合多种免疫球蛋白的fc区段。天然的蛋白a有5个igg结合结构域和未知功能的非fc结合域。此结构的蛋白a大量结合igg的同时，其非fc结合域会结合部分杂蛋白。重组蛋白a(recombinantproteina，rpa)是根据野生型蛋白a的序列信息，设计筛选获得稳定性及产量较优蛋白a，由大肠杆菌表达，经镍柱纯化获得，纯度大于95％，可耐受0.5m的naoh和0.5m的hcl处理，不降解、抗体结合能力不变，并且不结合其他杂蛋白。rpa可结合大多数人或小鼠免疫球蛋白子类(如人igg1、igg2、igg4；小鼠igg2、igg2a、igg2b、igg3)，还可结合牛、猪、仓鼠、兔的总免疫球蛋白。rpa的c末端修饰有半胱氨酸，可定向偶联到材料表面，提高材料表面fc结合位点密度。与半胱氨酸的巯基残基反应的常用策略有碘乙酰基团、3-溴乙烯基团的卤素取代反应，和巯基与马来酰亚胺的加成反应；但组氨酸的咪唑基侧链和甲硫氨酸的硫醚残基同样可与碘和溴发生卤素取代反应，而巯基的加成反应速度较慢，反应过程中巯基会自氧化形成双硫键，需要小心控制。3.表面羧基化或氨基化的纳米粒子需要通过羧基和氨基的共价连接完成与抗体的偶联，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)是常用的反应活化剂。然而，纳米粒子和抗体通过羧基和氨基的共价连接得到的免疫探针，其表面的抗体伸展方向是随机的；大部分抗体存在多个氨基和羧基残基，容易产生纳米粒子和抗体的相互交联进而引发不可逆聚集；共价偶联过程中会影响抗体活性。4.基于上述情况，发明人研究开发了一种利用rpa的c端半胱氨酸巯基与纳米粒子表面氯乙酰基团发生取代反应，将rpa定向偶联到纳米粒子表面，进而定向偶联抗体的双重定向偶联免疫探针的制备方法，目前，尚未有纳米粒子使用该偶联方式进行定向偶联并应用的相关报道。技术实现要素：5.本发明旨在提供一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，该制备方法具有高效、易于制备、重复性良好的优点，制备得到定向偶联rpa的纳米粒子分散性好，可实现抗体的定向偶联，提高抗体利用效率和免疫探针识别性能。6.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：7.本发明提供了一种重组蛋白a(rpa)的双重定向偶联免疫探针的制备方法，包括如下步骤：8.对于表面羧基化的纳米粒子，将纳米粒子作为信号输出材料，分散于ph＝6的0.01m4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲体系中，加入2-氯乙酰肼盐酸盐和碳二亚胺edc于室温反应90min，随后加入0.1m甘氨酸淬灭剩余的edc和活化羧基位点，离心后将沉积物重悬于0.1m的碳酸氢钠溶液中；随后加入经三(2-羧乙基)膦(tcep)预处理的rpa室温反应60min，随后用0.1m半胱氨酸淬灭剩余的氯取代反应位点，离心后将沉积物重悬于0.01mtris缓冲液中，即制得定向偶联rpa的纳米粒子。9.对于表面氨基化的纳米粒子，将纳米粒子作为信号输出材料，分散于四氢呋喃(thf)溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入氯乙酰氯反应120min，离心后将沉积物重悬于0.1m的碳酸氢钠溶液中；后续修饰反应同表面羧基化的纳米粒子相同。10.对于表面羟基化的纳米粒子，制备方法与表面氨基化的纳米粒子相同。11.得到定向偶联rpa的纳米粒子后，在ph为7.5～8.0的缓冲液中结合抗体，形成双重定向偶联免疫探针。12.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，表面羧基化的纳米粒子连接臂2-氯乙酰肼盐酸盐添加浓度控制在50～250mg/g；表面氨基化和羟基化的纳米粒子连接臂氯乙酰氯添加浓度控制在20～100mg/g。13.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa需5mmtcep预处理30-60min。14.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa添加浓度控制在50～300mg/g。15.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa于纳米粒子反应体系为0.1m碳酸氢钠溶液。16.进一步的，所述双重定向偶联免疫探针的制备方法中，定向偶联rpa的纳米粒子结合抗体的缓冲ph为7.5～8.0。17.本发明还包括上述方法制得的重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针。18.本发明的有益效果是：19.1、本发明提供的方法，通过连接臂将重组蛋白a定向偶联于纳米粒子表面，简单高效，提高纳米粒子表面抗体fc片段结合位点的密度，不影响信号输出，不影响抗体结合活性，直接应用于抗体的识别。20.2、本发明首次使用了氯乙酰基团与重组蛋白a的巯基残基反应用于定向偶联，能避免卤素取代位置与组氨酸、甲硫氨酸的副反应。21.3、本发明修饰纳米粒子表面使用的氯乙酰肼和氯乙酰氯为异型双功能偶联剂，可避免纳米粒子共价偶联时与蛋白产生交联引发聚集。22.4、本发明使用的双重定向偶联能提高抗体的使用效率，进一步提高所得免疫探针对抗原的亲和作用。附图说明23.图1是本发明的双重定向偶联原理。24.图2是双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针用于免疫层析试纸条检测恩诺沙星原理。25.图3是双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针用于免疫层析试纸条检测e.colio157：h7原理。26.图4是双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针用于elisa检测e.colio157：h7原理。27.图5是aiefm随机共价偶联抗恩诺沙星抗体前后水化粒径。28.图6是aiefm使用本发明双重定向偶联的各阶段水化粒径。29.图7是表征免疫探针定向偶联率原理。30.图8是实施例1和对比例3中免疫探针的抗体定向偶联率。具体实施方式31.实施例1：以聚集诱导发光微球(aiefm)为纳米粒子，制备双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针，用于免疫层析试纸条检测恩诺沙星。32.一、在表面羧基化的aiefm(水化粒径为100nm)表面修饰氯乙酰基团，按图1a所示原理合成免疫探针，取10μlaiefm(10mg/ml)；分散于950μl的mes缓冲液(0.01m，ph＝6)中；加入20μl2-氯乙酰肼盐酸盐溶液(10mg/ml)和edc溶液(10mg/ml)，室温反应90min，加入100μl甘氨酸溶液(0.1m)，室温反应30min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl碳酸氢钠溶液(0.1m)复溶。33.二、定向偶联rpa：向上述复溶液中加入100μlrpa溶液(0.2mg/ml)，室温反应60min，加入100μl半胱氨酸溶液(0.1m)，室温反应60min，12633g离心30min，离心所得沉积物用880μltris缓冲液(0.01m，ph＝8.0)复溶。34.三、定向偶联抗恩诺沙星抗体：向上述溶液中加入100μl抗恩诺沙星抗体溶液(20μg/ml)，室温孵育60min，11743g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针，原理如图1所示。免疫探针用于免疫层析试纸条检测恩诺沙星原理见图2。35.实施例2：以时间分辨荧光微球(trfm)为纳米粒子，制备双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针，用于免疫层析试纸条检测e.colio157：h7。36.一、在表面羧基化的trfm(水化粒径为180nm)表面修饰氯乙酰基团，按图1a所示原理合成免疫探针，取10μltrfm(10mg/ml)；分散于950μl的mes缓冲液(0.01m，ph＝6)中；加入20μl氯乙酰肼溶液(10mg/ml)和edc溶液(10mg/ml)，室温反应90min，加入100μl甘氨酸溶液(0.1m)，室温反应30min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl碳酸氢钠溶液(0.1m)复溶。37.二、定向偶联rpa：向上述复溶液中加入100μlrpa溶液(0.25mg/ml)，室温反应60min，加入100μl半胱氨酸溶液(0.1m)，室温反应60min，12633g离心30min，离心所得沉积物用880μltris缓冲液(0.01m，ph＝8.0)复溶。38.三、定向偶联e.colio157：h7抗体：向上述溶液中加入100μl抗e.colio157：h7抗体溶液(100μg/ml)，室温孵育60min，11743g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针。免疫探针用于免疫层析试纸条检测e.colio157：h7原理见图3。39.实施例3：以量子点荧光微球(qdfm)为纳米粒子，制备双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针，用于elisa检测e.colio157：h7。40.一、在表面氨基化的qdfm(水化粒径为180nm)表面修饰氯乙酰基团，按图1b所示原理合成免疫探针，取10μlqdfm(10mg/ml)；分散于950μl的四氢呋喃中；加入20μl三乙胺和氯乙酰氯，室温反应120min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl碳酸氢钠溶液(0.1m)复溶。41.二、定向偶联rpa：向上述复溶液中加入100μlrpa溶液(0.2mg/ml)，室温反应60min，加入100μl半胱氨酸溶液(0.1m)，室温反应60min，12633g离心30min，离心所得沉积物用880μltris缓冲液(0.01m，ph＝8.0)复溶。42.三、定向偶联e.colio157：h7抗体：向上述溶液中加入100μl抗e.colio157：h7抗体溶液(80μg/ml)，室温孵育60min，11743g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针。免疫探针用于elisa检测e.colio157：h7原理见图4。43.对比例1：rpa与量子点随机偶联合成免疫探针44.以量子点为纳米粒子，与rpa随机偶联再定向偶联抗体，免疫探针合成方法来自文献(universalfluorescencenanoprobestoenhancethesensitivityofimmunochromatographicassayfordetectionof17β-estradiolinmilk.foodchemistry[j].2022，370，131027)中的报道，rpa与纳米粒子通过活化羧基与氨基的反应进行随机偶联。[0045]对比例2：用c端含半胱氨酸标签的重组monobody与纳米粒子进行定向偶联[0046]文献(monobodyadapterforfunctionalantibodydisplayonnanoparticlesforadaptabletargeteddeliveryapplications.naturecommunication[j].2022，13，5998)中报道c端含半胱氨酸标签的重组抗小鼠iggfc片段monobody与纳米粒子进行定向偶联。使用聚乳酸-聚乙二醇纳米粒子时，表面修饰马来酰亚胺基团与monobodyc端的半胱氨酸巯基进行定向偶联，发生巯基与双键的加成反应；使用聚氨酯纳米粒子时，用乙烯砜修饰聚氨酯纳米粒子表面以展示砜乙烯基与巯基发生加成反应，进行monobody的定向偶联。后续经抗小鼠iggfc片段monobody识别小鼠iggfc片段进行小鼠igg的定向偶联。[0047]对比例3[0048]使用实施例1中使用的表面羧基化的aiefm(水化粒径为100nm)，使用edc/nhs活化aiefm表面羧基，与抗恩诺沙星抗体进行随机的共价偶联。[0049]偶联方法如下：将10μlaiefm(10mg/ml)；分散于950μl的mes缓冲液(0.01m，ph＝6)中，加入20μledc溶液(10mg/ml)和nhs溶液(10mg/ml)，室温反应60min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl的硼酸缓冲液(0.01m，ph＝6.5)复溶，加入100μl抗恩诺沙星抗体溶液(80μg/ml)，室温反应60min；10005g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到随机偶联的恩诺沙星免疫探针。[0050]偶联前后水化粒径变化如图5所示。偶联后免疫探针水化粒径相比aiefm变化大，且分散性变差。[0051]实施例4：双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针表征[0052]分别取实施例1各偶联阶段纳米粒子测定水化粒径，结果如图6所示。[0053]aiefm修饰氯乙酰基团后，水化粒径没有明显的变化，保持良好的分散性；aiefm定向偶联rpa后，水化粒径增加，保持良好的分散性；aiefm定向偶联rpa再定向偶联抗恩诺沙星抗体后，水化粒径再次增加，并保持良好的分散性。与对比例3相比，双重定向偶联前后水化粒径仅随蛋白质的偶联呈现较小水化粒径变化，且分散性始终良好。[0054]实施例5：免疫探针定向偶联率分析[0055]将实施例1和对比例3制得的免疫探针进行抗体偶联率和定向偶联率分析，使用alexa647标记的羊抗鼠f(ab`)2抗体表征两种探针的定向偶联率。表征原理如图7所示。使用elisa对抗体偶联后的离心上清液进行抗体定量，得到免疫探针的抗体偶联量，定义定向偶联的抗体量与抗体偶联量的比值为定向偶联率。得到结果如图8所示，双重定向偶联的免疫探针定向偶联率为89.1％，高于随机偶联的免疫探针。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明属于食品安全检测和医学检验领域，具体涉及一种在纳米粒子表面定向偶联重组蛋白a进而定向偶联抗体的双重定向偶联免疫探针的制备方法。
背景技术：
：：2.蛋白a(proteina，pa)是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能够特异性地结合多种免疫球蛋白的fc区段。天然的蛋白a有5个igg结合结构域和未知功能的非fc结合域。此结构的蛋白a大量结合igg的同时，其非fc结合域会结合部分杂蛋白。重组蛋白a(recombinantproteina，rpa)是根据野生型蛋白a的序列信息，设计筛选获得稳定性及产量较优蛋白a，由大肠杆菌表达，经镍柱纯化获得，纯度大于95％，可耐受0.5m的naoh和0.5m的hcl处理，不降解、抗体结合能力不变，并且不结合其他杂蛋白。rpa可结合大多数人或小鼠免疫球蛋白子类(如人igg1、igg2、igg4；小鼠igg2、igg2a、igg2b、igg3)，还可结合牛、猪、仓鼠、兔的总免疫球蛋白。rpa的c末端修饰有半胱氨酸，可定向偶联到材料表面，提高材料表面fc结合位点密度。与半胱氨酸的巯基残基反应的常用策略有碘乙酰基团、3-溴乙烯基团的卤素取代反应，和巯基与马来酰亚胺的加成反应；但组氨酸的咪唑基侧链和甲硫氨酸的硫醚残基同样可与碘和溴发生卤素取代反应，而巯基的加成反应速度较慢，反应过程中巯基会自氧化形成双硫键，需要小心控制。3.表面羧基化或氨基化的纳米粒子需要通过羧基和氨基的共价连接完成与抗体的偶联，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)是常用的反应活化剂。然而，纳米粒子和抗体通过羧基和氨基的共价连接得到的免疫探针，其表面的抗体伸展方向是随机的；大部分抗体存在多个氨基和羧基残基，容易产生纳米粒子和抗体的相互交联进而引发不可逆聚集；共价偶联过程中会影响抗体活性。4.基于上述情况，发明人研究开发了一种利用rpa的c端半胱氨酸巯基与纳米粒子表面氯乙酰基团发生取代反应，将rpa定向偶联到纳米粒子表面，进而定向偶联抗体的双重定向偶联免疫探针的制备方法，目前，尚未有纳米粒子使用该偶联方式进行定向偶联并应用的相关报道。技术实现要素：5.本发明旨在提供一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，该制备方法具有高效、易于制备、重复性良好的优点，制备得到定向偶联rpa的纳米粒子分散性好，可实现抗体的定向偶联，提高抗体利用效率和免疫探针识别性能。6.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：7.本发明提供了一种重组蛋白a(rpa)的双重定向偶联免疫探针的制备方法，包括如下步骤：8.对于表面羧基化的纳米粒子，将纳米粒子作为信号输出材料，分散于ph＝6的0.01m4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲体系中，加入2-氯乙酰肼盐酸盐和碳二亚胺edc于室温反应90min，随后加入0.1m甘氨酸淬灭剩余的edc和活化羧基位点，离心后将沉积物重悬于0.1m的碳酸氢钠溶液中；随后加入经三(2-羧乙基)膦(tcep)预处理的rpa室温反应60min，随后用0.1m半胱氨酸淬灭剩余的氯取代反应位点，离心后将沉积物重悬于0.01mtris缓冲液中，即制得定向偶联rpa的纳米粒子。9.对于表面氨基化的纳米粒子，将纳米粒子作为信号输出材料，分散于四氢呋喃(thf)溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入氯乙酰氯反应120min，离心后将沉积物重悬于0.1m的碳酸氢钠溶液中；后续修饰反应同表面羧基化的纳米粒子相同。10.对于表面羟基化的纳米粒子，制备方法与表面氨基化的纳米粒子相同。11.得到定向偶联rpa的纳米粒子后，在ph为7.5～8.0的缓冲液中结合抗体，形成双重定向偶联免疫探针。12.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，表面羧基化的纳米粒子连接臂2-氯乙酰肼盐酸盐添加浓度控制在50～250mg/g；表面氨基化和羟基化的纳米粒子连接臂氯乙酰氯添加浓度控制在20～100mg/g。13.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa需5mmtcep预处理30-60min。14.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa添加浓度控制在50～300mg/g。15.进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa于纳米粒子反应体系为0.1m碳酸氢钠溶液。16.进一步的，所述双重定向偶联免疫探针的制备方法中，定向偶联rpa的纳米粒子结合抗体的缓冲ph为7.5～8.0。17.本发明还包括上述方法制得的重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针。18.本发明的有益效果是：19.1、本发明提供的方法，通过连接臂将重组蛋白a定向偶联于纳米粒子表面，简单高效，提高纳米粒子表面抗体fc片段结合位点的密度，不影响信号输出，不影响抗体结合活性，直接应用于抗体的识别。20.2、本发明首次使用了氯乙酰基团与重组蛋白a的巯基残基反应用于定向偶联，能避免卤素取代位置与组氨酸、甲硫氨酸的副反应。21.3、本发明修饰纳米粒子表面使用的氯乙酰肼和氯乙酰氯为异型双功能偶联剂，可避免纳米粒子共价偶联时与蛋白产生交联引发聚集。22.4、本发明使用的双重定向偶联能提高抗体的使用效率，进一步提高所得免疫探针对抗原的亲和作用。附图说明23.图1是本发明的双重定向偶联原理。24.图2是双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针用于免疫层析试纸条检测恩诺沙星原理。25.图3是双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针用于免疫层析试纸条检测e.colio157：h7原理。26.图4是双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针用于elisa检测e.colio157：h7原理。27.图5是aiefm随机共价偶联抗恩诺沙星抗体前后水化粒径。28.图6是aiefm使用本发明双重定向偶联的各阶段水化粒径。29.图7是表征免疫探针定向偶联率原理。30.图8是实施例1和对比例3中免疫探针的抗体定向偶联率。具体实施方式31.实施例1：以聚集诱导发光微球(aiefm)为纳米粒子，制备双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针，用于免疫层析试纸条检测恩诺沙星。32.一、在表面羧基化的aiefm(水化粒径为100nm)表面修饰氯乙酰基团，按图1a所示原理合成免疫探针，取10μlaiefm(10mg/ml)；分散于950μl的mes缓冲液(0.01m，ph＝6)中；加入20μl2-氯乙酰肼盐酸盐溶液(10mg/ml)和edc溶液(10mg/ml)，室温反应90min，加入100μl甘氨酸溶液(0.1m)，室温反应30min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl碳酸氢钠溶液(0.1m)复溶。33.二、定向偶联rpa：向上述复溶液中加入100μlrpa溶液(0.2mg/ml)，室温反应60min，加入100μl半胱氨酸溶液(0.1m)，室温反应60min，12633g离心30min，离心所得沉积物用880μltris缓冲液(0.01m，ph＝8.0)复溶。34.三、定向偶联抗恩诺沙星抗体：向上述溶液中加入100μl抗恩诺沙星抗体溶液(20μg/ml)，室温孵育60min，11743g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针，原理如图1所示。免疫探针用于免疫层析试纸条检测恩诺沙星原理见图2。35.实施例2：以时间分辨荧光微球(trfm)为纳米粒子，制备双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针，用于免疫层析试纸条检测e.colio157：h7。36.一、在表面羧基化的trfm(水化粒径为180nm)表面修饰氯乙酰基团，按图1a所示原理合成免疫探针，取10μltrfm(10mg/ml)；分散于950μl的mes缓冲液(0.01m，ph＝6)中；加入20μl氯乙酰肼溶液(10mg/ml)和edc溶液(10mg/ml)，室温反应90min，加入100μl甘氨酸溶液(0.1m)，室温反应30min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl碳酸氢钠溶液(0.1m)复溶。37.二、定向偶联rpa：向上述复溶液中加入100μlrpa溶液(0.25mg/ml)，室温反应60min，加入100μl半胱氨酸溶液(0.1m)，室温反应60min，12633g离心30min，离心所得沉积物用880μltris缓冲液(0.01m，ph＝8.0)复溶。38.三、定向偶联e.colio157：h7抗体：向上述溶液中加入100μl抗e.colio157：h7抗体溶液(100μg/ml)，室温孵育60min，11743g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针。免疫探针用于免疫层析试纸条检测e.colio157：h7原理见图3。39.实施例3：以量子点荧光微球(qdfm)为纳米粒子，制备双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针，用于elisa检测e.colio157：h7。40.一、在表面氨基化的qdfm(水化粒径为180nm)表面修饰氯乙酰基团，按图1b所示原理合成免疫探针，取10μlqdfm(10mg/ml)；分散于950μl的四氢呋喃中；加入20μl三乙胺和氯乙酰氯，室温反应120min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl碳酸氢钠溶液(0.1m)复溶。41.二、定向偶联rpa：向上述复溶液中加入100μlrpa溶液(0.2mg/ml)，室温反应60min，加入100μl半胱氨酸溶液(0.1m)，室温反应60min，12633g离心30min，离心所得沉积物用880μltris缓冲液(0.01m，ph＝8.0)复溶。42.三、定向偶联e.colio157：h7抗体：向上述溶液中加入100μl抗e.colio157：h7抗体溶液(80μg/ml)，室温孵育60min，11743g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到双重定向偶联的e.colio157：h7免疫探针。免疫探针用于elisa检测e.colio157：h7原理见图4。43.对比例1：rpa与量子点随机偶联合成免疫探针44.以量子点为纳米粒子，与rpa随机偶联再定向偶联抗体，免疫探针合成方法来自文献(universalfluorescencenanoprobestoenhancethesensitivityofimmunochromatographicassayfordetectionof17β-estradiolinmilk.foodchemistry[j].2022，370，131027)中的报道，rpa与纳米粒子通过活化羧基与氨基的反应进行随机偶联。[0045]对比例2：用c端含半胱氨酸标签的重组monobody与纳米粒子进行定向偶联[0046]文献(monobodyadapterforfunctionalantibodydisplayonnanoparticlesforadaptabletargeteddeliveryapplications.naturecommunication[j].2022，13，5998)中报道c端含半胱氨酸标签的重组抗小鼠iggfc片段monobody与纳米粒子进行定向偶联。使用聚乳酸-聚乙二醇纳米粒子时，表面修饰马来酰亚胺基团与monobodyc端的半胱氨酸巯基进行定向偶联，发生巯基与双键的加成反应；使用聚氨酯纳米粒子时，用乙烯砜修饰聚氨酯纳米粒子表面以展示砜乙烯基与巯基发生加成反应，进行monobody的定向偶联。后续经抗小鼠iggfc片段monobody识别小鼠iggfc片段进行小鼠igg的定向偶联。[0047]对比例3[0048]使用实施例1中使用的表面羧基化的aiefm(水化粒径为100nm)，使用edc/nhs活化aiefm表面羧基，与抗恩诺沙星抗体进行随机的共价偶联。[0049]偶联方法如下：将10μlaiefm(10mg/ml)；分散于950μl的mes缓冲液(0.01m，ph＝6)中，加入20μledc溶液(10mg/ml)和nhs溶液(10mg/ml)，室温反应60min；15633g离心30min，离心所得沉积物用980μl的硼酸缓冲液(0.01m，ph＝6.5)复溶，加入100μl抗恩诺沙星抗体溶液(80μg/ml)，室温反应60min；10005g离心30min，离心所得沉积物用100μlpbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)复溶得到随机偶联的恩诺沙星免疫探针。[0050]偶联前后水化粒径变化如图5所示。偶联后免疫探针水化粒径相比aiefm变化大，且分散性变差。[0051]实施例4：双重定向偶联的恩诺沙星免疫探针表征[0052]分别取实施例1各偶联阶段纳米粒子测定水化粒径，结果如图6所示。[0053]aiefm修饰氯乙酰基团后，水化粒径没有明显的变化，保持良好的分散性；aiefm定向偶联rpa后，水化粒径增加，保持良好的分散性；aiefm定向偶联rpa再定向偶联抗恩诺沙星抗体后，水化粒径再次增加，并保持良好的分散性。与对比例3相比，双重定向偶联前后水化粒径仅随蛋白质的偶联呈现较小水化粒径变化，且分散性始终良好。[0054]实施例5：免疫探针定向偶联率分析[0055]将实施例1和对比例3制得的免疫探针进行抗体偶联率和定向偶联率分析，使用alexa647标记的羊抗鼠f(ab`)2抗体表征两种探针的定向偶联率。表征原理如图7所示。使用elisa对抗体偶联后的离心上清液进行抗体定量，得到免疫探针的抗体偶联量，定义定向偶联的抗体量与抗体偶联量的比值为定向偶联率。得到结果如图8所示，双重定向偶联的免疫探针定向偶联率为89.1％，高于随机偶联的免疫探针。当前第1页12当前第1页12
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