一种基于重组蛋白A的双重定向偶联免疫探针的制备方法

技术特征：
1.一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，在纳米粒子表面修饰氯乙酰基团，与重组蛋白a的c端半胱氨酸巯基发生取代反应，定向偶联重组蛋白a；再经重组蛋白a定向结合抗体fc片段，制得双重定向偶联免疫探针。2.根据权利要求1所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述纳米粒子为表面羧基化或氨基化或羟基化的纳米粒子。3.根据权利要求1或2所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)在表面羧基化或氨基化或羟基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团；将表面羧基化的纳米粒子作为信号输出材料，分散于4-吗啉乙磺酸缓冲体系中，加入2-氯乙酰肼盐酸盐和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐于室温反应，反应后加入甘氨酸淬灭剩余的edc和活化羧基位点，离心后将沉积物重悬于碳酸氢钠溶液中，得到表面修饰氯乙酰基团的纳米粒子；将表面氨基化或羟基化的纳米粒子作为信号输出材料，分散于四氢呋喃溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入氯乙酰氯反应，反应后经离心处理将沉积物重悬于碳酸氢钠溶液中，得到表面修饰氯乙酰基团的纳米粒子；(2)修饰反应制得定向偶联重组蛋白a的纳米粒子；在表面修饰氯乙酰基团的纳米粒子中，加入经三(2-羧乙基)膦(tcep)预处理的重组蛋白a室温反应60min，随后用半胱氨酸淬灭剩余的氯取代反应位点，离心后将沉积物重悬于tris缓冲液中，即制得定向偶联重组蛋白a的纳米粒子；(3)定向偶联重组蛋白a的纳米粒子在缓冲液中结合抗体，形成双重定向偶联免疫探针。4.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中在表面羧基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团时，连接臂2-氯乙酰肼盐酸盐添加浓度控制在50～250mg/g；在表面氨基化和羟基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团时，连接臂氯乙酰氯添加浓度控制在20～100mg/g。5.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组蛋白a在5mm tcep预处理30-60min。6.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组蛋白a添加浓度控制在50～300mg/g。7.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组蛋白a与纳米粒子反应体系为0.1m碳酸氢钠溶液。8.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，定向偶联重组蛋白a的纳米粒子结合抗体的缓冲液ph为7.5～8.0。9.权利要求1至8任意一项所述制备方法制得的基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针。

技术总结
本发明公开了一种基于重组蛋白A的双重定向偶联免疫探针制备方法。通过在表面羧基化或氨基化或羟基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团，与重组蛋白A的C端半胱氨酸巯基进行取代反应，定向偶联重组蛋白A；再经重组蛋白A对抗体Fc片段特异性结合进行抗体的定向偶联。本发明定向偶联重组蛋白A能提高纳米粒子表面Fc片段结合位点密度，提高抗体使用效率、避免纳米粒子与抗体交联聚集，进而提高所得免疫探针对抗原的亲和作用，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：赖卫华 胡立文 彭娟 熊勇华 魏华 黄小林
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/24