检测牛细小病毒3型的实时PCR方法与流程

技术特征：
1.一种组合物，该组合物包含选自由以下各项组成的组的寡核苷酸：a)具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的核酸序列的寡核苷酸；b)具有seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的核酸序列的寡核苷酸；c)具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的寡核苷酸；d)具有seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12的核酸序列的寡核苷酸；e)具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的核酸序列的寡核苷酸；f)具有seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22的核酸序列的寡核苷酸；g)具有seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的核酸序列的寡核苷酸；以及h)具有seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28的核酸序列的寡核苷酸。2.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物任选地包含第二组合物，该第二组合物包含具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的序列的寡核苷酸。3.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物包含具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的寡核苷酸。4.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物包含第一组合物以及第二组合物，该第一组合物包含具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的寡核苷酸，该第二组合物包含具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的序列的寡核苷酸。5.一种试剂，该试剂用于检测测试样本的经提取的dna中的牛细小病毒3型(bpv-3)基因组dna，该试剂选自由以下各项组成的组：a)具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12的核酸序列的引物探针组合；e)具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的核酸序列的引物探针组合；f)具有seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22的核酸序列的引物探针组合；g)具有seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的核酸序列的引物探针组合；以及h)具有seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28的核酸序列的引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂，其中seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15、seq id no:22、seq id no:25或seq id no:28具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。7.根据权利要求5所述的试剂，其中seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15、seq id no:22、seq id no:25或seq id no:28中的一者或多者在5’末端具有荧光报告染料6-羧基荧光素(fam)且/或在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)或者具有zen-ib与iowa black荧光淬灭剂(ibfq)。8.根据权利要求5所述的试剂，其中该引物探针组合检测该测试样本中的编码牛细小病毒3型的结构衣壳(vp)蛋白和/或非结构(ns)蛋白的dna。9.根据权利要求5所述的试剂，该试剂与内部阳性对照引物组合联合使用。10.根据权利要求5所述的试剂，该试剂包含seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9。
11.一种试剂，该试剂在用于检测测试样本的经提取的dna中的牛细小病毒3型(bpv-3)基因组dna的测定中用作内部阳性对照引物探针组合，该试剂包含引物探针组合。12.根据权利要求11所述的试剂，其中该引物探针组合具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的核酸序列。13.根据权利要求11所述的试剂，其中seq id no:18具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。14.根据权利要求13所述的试剂，其中seq id no:18在5’末端具有荧光报告染料2
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氯-7’苯基-1,4-二氯-6-羧基-荧光素(vic)并且在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)。15.一种引物探针组合，该引物探针组合用于检测测试样本的经提取的dna中的牛细小病毒3型基因组dna，其与用于检测牛细小病毒3型(bpv-3)基因组dna的内部阳性对照引物探针组合联合使用。16.根据权利要求15所述的用于检测牛细小病毒3型基因组dna的引物探针组合，其中该引物探针组合选自由以下各项组成的组：a)具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12的核酸序列的引物探针组合；e)具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的核酸序列的引物探针组合；f)具有seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22的核酸序列的引物探针组合；g)具有seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的核酸序列的引物探针组合；以及h)具有seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28的核酸序列的引物探针组合。17.根据权利要求16所述的引物探针组合，其中seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。18.根据权利要求16所述的引物探针组合，其中seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15、seq id no:22、seq id no:25或seq id no:28中的一者或多者在5’末端具有荧光报告染料6-羧基荧光素(fam)且/或在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)或者具有zen-ib与iowa black荧光淬灭剂(ibfq)。19.根据权利要求15所述的引物探针组合，其中该引物探针组合检测测试样本中的编码牛细小病毒3型的结构衣壳(vp)蛋白和/或非结构(ns)蛋白的dna。20.根据权利要求15所述的用于检测测试样本中的牛细小病毒3型(bpv-3)基因组dna的内部阳性对照引物探针组合，其中该引物探针组合具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的核酸序列。21.根据权利要求20所述的内部阳性对照引物探针组合，其中seq id no:18具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。22.根据权利要求20所述的引物探针组合，其中seq id no:18在5’末端具有荧光报告染料2
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氯-7’苯基-1,4-二氯-6-羧基-荧光素(vic)并且在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)。
23.一种引物探针组合，该引物探针组合用于检测测试样本的经提取的dna中的牛细小病毒3型基因组dna，该引物探针组合包含seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9，其与包含seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的内部阳性对照引物探针组合联合使用，其中seq id no:9在5’末端具有荧光报告染料6-羧基荧光素并且在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)非荧光淬灭剂，并且seq id no:18在5’末端具有荧光报告染料2
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氯-7’苯基-1,4-二氯-6-羧基-荧光素并且在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)。24.一种试剂盒，该试剂盒用于检测测试样本的经提取的dna中的牛细小病毒3型(bpv-3)基因组dna污染，其包括检测编码bpv-3的dna的引物探针组合，该引物探针组合选自由以下各项组成的组：a)具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12的核酸序列的引物探针组合；e)具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的核酸序列的引物探针组合；f)具有seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22的核酸序列的引物探针组合；g)具有seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的核酸序列的引物探针组合；以及h)具有seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28的核酸序列的引物探针组合；以及任选地，具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的核酸序列的内部阳性对照引物探针组合。25.一种用于确定测试样本的经提取的dna中是否存在牛细小病毒3型基因组dna的方法，该方法包括1)包含以下各项的反应混合物：测试样本，阳性对照，bpv-3_ipc阳性对照质粒dna，核酸扩增试剂，具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的核酸序列的内部阳性对照引物探针组合，以及对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合，其中seq id no:18在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂，该对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合选自由以下各项组成的组：a)具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:3在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；b)具有seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:6在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；c)具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:9在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；d)具有seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:12在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；e)具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:15在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；
f)具有seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:22在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；g)具有seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:25在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；以及h)具有seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:28在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；2)对该反应混合物进行定量pcr技术以获得目标序列的拷贝，3)测量任何荧光信号增加，其中荧光信号增加表明该测试样本中存在牛细小病毒3型基因组dna。26.根据权利要求25所述的方法，其中该荧光报告染料是6-羧基荧光素(fam)并且该非荧光淬灭剂是小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)或是zen-ib与iowa black荧光淬灭剂(ibfq)。27.根据权利要求25所述的方法，该方法进一步包括一个或多个阴性提取对照、无模板对照、阳性提取对照、阳性对照和/或抑制对照。28.根据权利要求25所述的方法，其中检测的灵敏度或分析限是每个反应22个基因组拷贝。29.根据权利要求25所述的方法，其中样本检出限为每个反应25个基因组拷贝。30.根据权利要求25所述的方法，其中该对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合检测编码牛细小病毒3型的非结构(ns)蛋白和/或结构衣壳(vp)蛋白的dna。31.根据权利要求25所述的方法，其中该对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合扩增144bp片段。32.根据权利要求25所述的方法，其中该对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合包含seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的组合，其中seq id no:9在5’末端具有6-羧基荧光素(fam)并且在3’末端具有小沟结合剂(mgb-nfq)。33.根据权利要求25所述的方法，该方法进一步包括内部阳性对照引物探针组合。34.根据权利要求33所述的方法，其中该引物探针组合具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的核酸序列。35.根据权利要求34所述的方法，其中seq id no:18具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。36.根据权利要求34所述的方法，其中seq id no:18在5’末端具有荧光报告染料2
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氯-7’苯基-1,4-二氯-6-羧基-荧光素(vic)并且在3’末端具有小沟结合剂-非荧光淬灭剂(mgb-nfq)。37.一种用于在pcr反应中定量1e3至1e8个基因组拷贝的牛细小病毒3型基因组dna的方法，该方法包括1)包含以下各项的反应混合物：测试样本的经提取的dna，阳性对照，bpv-3_ipc阳性对照质粒dna，核酸扩增试剂，具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的核酸序列的内部阳性对照引物探针组合，以及对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合，其中seq id no:18在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂，该对牛细小病毒3型的dna序列具有选择性的引物探针组合选自由以下各项组成的组：
a)具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:3在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；b)具有seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:6在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；c)具有seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:9在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；d)具有seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:12在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；e)具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:15在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；f)具有seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:22在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；g)具有seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:25在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；以及h)具有seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28的核酸序列的引物探针组合，其中seq id no:28在5’末端具有荧光报告染料并且在3’末端具有非荧光淬灭剂；2)对该反应混合物进行定量pcr技术以获得目标序列的拷贝，以及3)测量任何荧光信号增加。38.根据权利要求37所述的方法，其中该方法的检出限(lod95％)是每个反应27个基因组拷贝的牛细小病毒3型基因组dna且95％置信区间为每个反应22个至34个基因组拷贝。39.根据权利要求37所述的方法，其中该方法的线性相关系数(r2)≥0.98且pcr扩增效率在90％-110％内。40.根据权利要求37所述的方法，其中该方法具有数量％cv等于或小于25％的重复性值。41.根据权利要求37所述的方法，其中该方法具有数量％cv等于或小于30％的中间精密度值。42.根据权利要求37所述的方法，其中该方法在测定的整个动态范围内具有在可接受参考值(st)的
±
30％内的准确度值。43.根据权利要求37所述的方法，其中该方法具有如下定量限：重复性的数量％cv≤25％，中间精密度≤30％且准确度的接受准则在预期标准参考值的
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30％内。44.根据权利要求37所述的方法，其中该方法具有稳健性，其重复性的数量％cv≤25％，中间精密度≤30％并且所测试组合矩阵条件的数量平均值的准确度在最佳化条件的数量平均值的
±
30％内。45.根据权利要求37所述的方法，其中该方法包括无模板对照、阳性对照、阴性提取对照、阳性提取对照、抑制对照、内部阳性对照和标准品中的一者或多者。

技术总结
本发明提供了用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型(BPV-3)基因组DNA的编码DNA的引物探针组合。还提供了内部阳性对照。照。照。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：美国安进公司
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2023/10/20