鸦胆子素A作为治疗乳腺癌药物的应用

鸦胆子素a作为治疗乳腺癌药物的应用
技术领域
1.本发明涉及乳腺癌治疗药物领域，特别涉及鸦胆子素a作为治疗乳腺癌药物的应用。


背景技术：

2.乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因。它的发病常与遗传有关，以及40—60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。它是一种通常发生在乳房腺上皮组织，严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌男性罕见，仅约1-2％的乳腺患者是男性。祖国医学对乳腺癌的认识早在《灵枢
·
痈疽篇》中就提及：“......”故命曰疽，疽者，上皮夭以坚，上如牛领之皮”。符合乳腺癌的橘皮样水肿表现。其后《诸病源候论》、《肘后备急方》、《千金方》、《外台秘要》等书中均有记载；明代《医学正传》曰：“乳癌始有核，肿结如鳖棋子大，不痛不痒，五七日方成疮，初宜多用疏肝理气行血之药，
……
若成疮之后，则如岩穴之凹，或如人口有唇，赤汁浓水浸yin，胸胁气攻疼痛。”至清代《医宗金鉴》载有：“乳岩初起如枣栗，渐如棋子，无红无热，有时隐痛
……
若年深日久，始觉大痛，牵引胸胁
……
腐烂深如岩壑，反花突如泛莲
……
即成败症”。据以上症候所述可以看出，中医所言“乳岩”、“乳癌”、“乳石痈”等的症状与现代医学所述的乳腺癌的症候极为相似，故乳腺癌在中医当属“乳岩”、“乳石痈”范畴。《诸病源候论
·
乳石痈候》：“石痈之状，微强不甚大，不赤，微痛热
……
但结核如石。”3.鸦胆子素a(bruceine a，ba)又称鸦胆子苦素a，是从植物鸦胆子[bruceine javanica(linnaeus)merrill]果实中提取分离的苦木内酯类化合物。中医认为，鸦胆子味苦、性寒，有小毒，归大肠、肝经，有清热、解毒、截疟、止痢和腐蚀赘疵之功效。在我国南部地区，鸦胆子多用作抗疟药，临床常将鸦胆子油乳剂用于肺癌及肺癌脑转移、肝癌和消化道肿瘤的辅助治疗，但关于鸦胆子中的单体成分ba是否具有抗肿瘤作用，目前尚无实验数据。
[0004]
鸦胆子素a的分子式：c26h34o11分子量：522.5416结构式如下：
[0005][0006]
关于鸦胆子素的应用很多，大部分为鸦胆子素d的相关专利，鸦胆子素a用于糖尿病肾病、骨代谢性疾病等。鸦胆子素a用于肿瘤治疗未见报道。


技术实现要素：

[0007]
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供鸦胆子素a作为治疗乳腺癌药物的应用。本发明鸦胆子素a治疗乳腺癌的新用途，从体内实验上证实鸦胆子素a对
乳腺癌细胞增殖的抑制作用，从体外实验上证实鸦胆子素a对乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移的抑制作用，从而证明鸦胆子素a可用于乳腺癌的治疗。本发明涉及的鸦胆子素a即可用于治疗乳腺癌的抗肿瘤药品制备。
[0008]
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0009]
鸦胆子素a作为治疗乳腺癌药物的应用所述鸦胆子素a分子式：c26h34o11分子量：522.5416结构式如下：
[0010][0011]
进一步的，所述应用具体为：鸦胆子素a能抑制乳腺癌细胞的生长。
[0012]
进一步的，所述应用具体为：鸦胆子素a诱导人乳腺癌细胞的凋亡。
[0013]
进一步的，所述应用具体为：鸦胆子素a抑制人乳腺癌细胞的增殖潜能。
[0014]
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0015]
鸦胆子素a作为治疗乳腺癌药物的应用；本发明鸦胆子素a治疗乳腺癌的新用途，从体内实验上证实鸦胆子素a对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，从体外实验上证实鸦胆子素a对乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移的抑制作用，从而证明鸦胆子素a可用于乳腺癌的治疗。本发明涉及的鸦胆子素a即可用于治疗乳腺癌的抗肿瘤药品制备。
附图说明
[0016]
图1：鸦胆子素a对人乳腺癌mcf-7、skbr3和mda-mb-231细胞的增殖抑制作用；
[0017]
图2：鸦胆子素a各剂量组处理乳腺癌细胞以后的凋亡率；
[0018]
图3：鸦胆子素a各剂量组抑制乳腺癌细胞的增殖潜能；
[0019]
图4.人乳腺癌mda-mb-231皮下移植肿瘤模型中各组肿瘤生长情况；
[0020]
图5：鸦胆子素a完成裸鼠mda-mb-231移植肿瘤给药后的瘤重。
具体实施方式
[0021]
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0022]
如图1-5所示，以下实施例所使用的实验材料如下：人乳腺癌细胞系mcf-7、skbr3和mda-mb-231由河南省工业微生物菌种工程技术研究中心提供；96孔板购自costar公司(目录号：3599)；rpmi1640培养基购自gibco公司(目录号：c11995500bt)；胎牛血清购自gibco公司(目录号：10270-106)；cck-8试剂盒购自美仑生物(目录号：ma0218)；dmso购自北京索莱宝科技有限公司(目录号：d8370)；鸦胆子素a(bruceine a，bra)购自湖北永阔科技有限公司(目录号jot-11226，批次22061309),hplc纯度98.73％，-20℃密封保存。
[0023]
以下实施例所使用的实验仪器如下:
[0024]
实验仪器:超净工作台(苏州净化型号bhc-1000iia2)，co2培养箱(thermo型号:3111)，酶标仪(thermo multiscan mk3)；
[0025]
实施例一：鸦胆子素a对人乳腺癌细胞生长的影响
[0026]
实验方法:称量2mg，加入0.38ml dmso溶解，配制成10mm/l溶液。使用cck-8法评价鸦胆子素a对人乳腺癌细胞的生长抑制作用：将人乳腺癌细胞(mcf-7、skbr3和mda-mb-231)用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清 90％rpmi1640培养基)混匀制成浓度为2
×
104个/ml的细胞悬液。将96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔2
×
103个细胞)，然后置于37℃5％co2培养箱中培养16小时；用完全培养基稀释药物至所需的不同梯度浓度(1.9nm/l-2000nm/l)，每孔加入100μl相应的含药培养基，同时设立溶媒(dmso)对照组和无细胞培养液对照，再将96孔板置于37℃5％co2培养箱中培养72小时。然后每孔加入20μl cck-8溶液，继续培养2小时，在λ＝450nm波长下用酶标仪检测每孔的吸光度即od值，以各复孔的平均值减去无细胞培养液平均值作为该组细胞的od值，与溶媒对照比较，计算药物处理后的细胞存活率。
[0027]
结果：见图1，鸦胆子素a对人乳腺癌mcf-7、skbr3和mda-mb-231细胞具有显著的生长抑制作用，其半数抑制浓度(ic50)均小于200nm/l，分别为96.4nm/l、134.7nm/l和9.4nm/l。
[0028]
图1：鸦胆子素a对人乳腺癌mcf-7、skbr3和mda-mb-231细胞的增殖抑制作用
[0029]
a.数据以“各作用浓度平均抑制率
±
标准偏差”表示。
[0030]
实施例二：鸦胆子素a对人乳腺癌细胞的凋亡诱导作用
[0031]
供试品：所述鸦胆子素a溶液由实施例一中所述方法制备而成。
[0032]
处理方法：将人乳腺癌细胞mda-mb-231用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清 90％rpmi1640培养基)混匀制成浓度为5
×
104个/ml的细胞悬液，加入预先置有盖玻片的24孔板，每孔加入0.5ml细胞悬液,然后置于37℃5％co2培养箱中培养16小时。设置溶剂对照组(dmso)、bra高剂量组(50nm/l)和bra低剂量组(10nm/l)。药物处理细胞72h后，pbs洗涤1次，加入4％多聚甲醛固定细胞爬片，然后加入100μltunel标记液标记凋亡细胞，避光孵育，使用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，每个细胞爬片在20
×
物镜视野下随机计数6个视野的tunel阳性细胞。
[0033]
结果：见图2，tunel实验结果表明，鸦胆子素a各剂量组(10nm/l和50nm/l)对mda-mb-231细胞的凋亡率均显著高于溶媒(dmso)对照组(bra(10nm/l)vs.溶媒，p《0.0001；bra(50nm/l)vs.溶媒，p《0.0001)。
[0034]
图2：鸦胆子素a各剂量组处理乳腺癌细胞以后的凋亡率；
[0035]
注：a.数据以“平均值
±
标准偏差”表示。
[0036]
b.用单因素方差分析(one-way anova)以及dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各剂量组之间细胞凋亡率的显著性差异。p值小于0.05被认为具有显著性差异。
[0037]
实施例三：鸦胆子素a抑制人乳腺癌细胞的增殖潜能(edu实验)
[0038]
供试品：所述鸦胆子素a溶液由实施例一中所述方法制备而成。
[0039]
处理方法：将人乳腺癌细胞mda-mb-231用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清 90％rpmi1640培养基)混匀制成浓度为5
×
104个/ml的细胞悬液，加入预加盖玻片的24孔培养板，每孔加入0.5ml细胞悬液，然后置于37℃5％co2培养箱中培养16小时。设置溶剂对照组(dmso)、bra高剂量组(50nm/l)和bra低剂量组(10nm/l)。药物处理48h后，加入10μm/l的edu溶液标记增殖细胞。pbs洗涤1次，加入4％多聚甲醛固定细胞爬片，然
后加入edu检测液避光孵育30分钟，使用含dapi的防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察edu标记情况，每个细胞爬片在20
×
物镜视野下随机计数4个视野的edu阳性细胞。结果：见图3，edu实验结果表明，与溶媒(dmso)对照组比较，鸦胆子素a各剂量组(10nm/l和50nm/l)均显著抑制mda-mb-231细胞的增殖潜能(bra(10nm/l)vs.溶媒，p《0.0001；bra(50nm/l)vs.溶媒，p《0.0001)。
[0040]
图3：鸦胆子素a各剂量组抑制乳腺癌细胞的增殖潜能；
[0041]
注：a.数据以“平均值
±
标准偏差”表示。
[0042]
b.用单因素方差分析(one-way anova)以及dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各剂量组之间细胞凋亡率的显著性差异。p值小于0.05被认为具有显著性差异。
[0043]
实施例四：裸鼠皮下移植乳腺癌细胞系mda-mb-231肿瘤模型的药效实验
[0044]
实验动物：balb/c裸鼠，雌雄各半，4周龄，体重约17g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：s c x k(湘)2019-0004，动物合格证编号：430727221102447121。饲养环境：spf级。
[0045]
实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度20-26℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm
×
210mm
×
180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物；实验动物打耳标进行标记。
[0046]
实验材料：鸦胆子素a(bruceine a，bra)购自湖北永阔科技有限公司(目录号jot-11226，批次22061309),hplc纯度98.73％，-20℃密封保存。peg300购自江苏省海安石油化工厂；pbs购自天津灏洋华科生物科技有限公司；dmso购自北京索莱宝科技有限公司。
[0047]
药物配制：称取鸦胆子素a粉末，溶解于溶媒溶液中(10％dmso 30％peg300 60％pbs)中。
[0048]
实验方法：人乳腺癌mda-mb-231细胞培养在含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液(购自美国gibco公司)中。收集指数生长期的mda-mb-231细胞，pbs重悬至适合浓度(2
×
107/ml)细胞悬液用于裸鼠皮下肿瘤接种。裸鼠右侧腋下接种100μl细胞悬液(含2
×
106mda-mb-231细胞)。待肿瘤生长至平均体积大约50mm3时，根据肿瘤大小随机分组，雌雄各半，分组当天给药，给药当天定义为第0天。裸鼠通过口服灌胃给药，给药体积为100μl/裸鼠。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤长径a和短径b。
[0049]
表1.给药方案说明书
[0050][0051]
实验结果：给药期间无裸鼠死亡，可以耐受给药。分组给药的第22天，溶媒对照组瘤体积762.6
±
119.3mm3，结束试验，取瘤并称瘤重。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
×
(a
×
b2)(其中a表示长径，b表示短径)。结束试验时，鸦胆子素a 200mg/kg给药组的平
均瘤体积为328.2
±
81.5mm3，相较对照组有统计学上的显著性差异(p《0.0001)(见图4)；
[0052]
图4.人乳腺癌mda-mb-231皮下移植肿瘤模型中各组肿瘤生长情况
[0053]
注：a.数据以“平均值
±
标准偏差”表示；
[0054]
b.用非配对t检验(welch's correction)比较溶媒对照组与日蟾毒它灵给药组之间瘤重的显著性差异。p值小于0.05被认为具有显著性差异。
[0055]
在实验终点采集肿瘤样本并测量瘤重(g)，其结果与瘤体积测量结果一致。给药组和对照组瘤重见图5。与溶剂对照瘤重(0.703
±
0.070g)相比，鸦胆子素a 200mg/kg给药后的瘤重为0.270
±
0.099g，差异具有显著意义(p《0.0001)。结果表明，鸦胆子素a在乳腺癌移植肿瘤模型中具有良好的体内抗肿瘤活性。
[0056]
图5：鸦胆子素a完成裸鼠mda-mb-231移植肿瘤给药后的瘤重
[0057]
注：a.数据以“平均值
±
标准偏差”表示；
[0058]
b.用非配对t检验(welch's correction)比较溶媒对照组与给药组之间瘤重的显著性差异。p值小于0.05被认为具有显著性差异。
[0059]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。