用于鉴定香菇杂交群体菌龄的InDel标记引物及鉴定方法与流程

用于鉴定香菇杂交群体菌龄的indel标记引物及鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及遗传育种技术领域，具体是用于鉴定香菇杂交群体菌龄的indel标记引物及鉴定方法。


背景技术：

2.香菇(lentinula edodes)是我国栽培起源最早，栽培地域最广泛的食用菌，产量多年居食用菌首位，2021年香菇产量达到1295.72万吨，占我国食用菌总产量的31.34％，在我国食用菌产业发展中具有重要地位。我国幅员辽阔，气候类型多样，香菇种质资源极为丰富，为香菇育种和栽培提供了丰富的种质类型。菌龄(vegetative growth rate，vgr)作为香菇栽培中最为重要的农艺性状之一，决定了一个菌株从营养生长到生殖生长的成熟时间即生产中菌株从接种到适合出菇的菌棒培养时间，生产上根据菌龄和当地最合适出菇季节而安排菌种制作时间和制棒生产时间。目前，随着香菇栽培规模的不断增加及栽培模式的设施化和集约化转型，对香菇不同类型品种的需求越来越高，其中设施化培养模式为了降低培养环节的成本，缩短出菇周期，对短菌龄品种的需求尤为迫切。目前香菇品种选育仍以传统杂交育种为主，对杂交群体菌龄的判断还是育种者根据杂交群体栽培出菇差异凭经验判断，菌龄性状还无法做到定向选育，这为选育高产、优质且菌龄短的品种增加了工作量和难度。目前分子标记辅助选择(mas)育种技术还缺乏成熟应用，这主要受制于缺少关键性状的定位和有效性分子标记的开发。香菇育种工作中，杂交群体优良性状的筛选一直是难点，特别是对大量杂交后代进行筛选时，需要小试、中试和大试等多轮重复，工作量大、成本高，非常耗时费力，且存在很大的盲目性。通过分子标记辅助进行定向选择带有目标性状的杂交后代，不仅省时、省力，而且准确性高、效率高，这在作物育种中已有大量的应用，但该方法在食用菌中目前还应用还较少。随着香菇高质量基因组组装完成及分子标记技术的成熟，为在香菇中利用分子标记进行定向选育奠定了基础。indel分子标记是一种基于高通量测序技术的应用，具有数量丰富、准确性高、稳定性好、分型快捷简便等优点，可以作为分子标记辅助选择育种的有效手段。
3.因此，开发一种用于鉴定香菇杂交群体菌龄的indel标记引物及其检测方法成为本领域的主要研究问题。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明还提供了一种用于鉴定香菇杂交群体菌龄的indel标记引物及鉴定方法，可用于香菇杂交群体杂交子长菌龄、短菌龄菌株早期筛选鉴定，进一步可用于香菇分子标记辅助育种。
5.为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
6.本发明的第一个方面，提供了一种用于鉴定香菇杂交群体菌龄的indel标记引物组合物，其特征在于，包括：
7.seq id no.1：3
’‑
caagagctaacgaattctccca-5’；
8.seq id no.2：3
’‑
ccctttgcgcatggtactag-5’。
9.优选的，所述引物扩增的indel标记位点为：chr2：4546550-4546814，标记位置为4546639-缺失77。
10.优选的，所述香菇包括931、l135。
11.本发明的第二个方面，提供了一种用于鉴定香菇杂交群体菌龄的试剂盒，所述试剂盒包括用于鉴定indel标记位点chr2：4546550-4546814、标记位置为4546639-缺失77的碱基、蛋白或化合物。
12.优选的，所述碱基包括：
13.seq id no.1：3
’‑
caagagctaacgaattctccca-5’；
14.seq id no.2：3
’‑
ccctttgcgcatggtactag-5’。
15.优选的，所述香菇包括931、l135。
16.本发明的第三个方面，提供了一种用于鉴定香菇杂交群体菌龄的方法，包括以下步骤：
17.s1、获取香菇的dna；
18.s2、pcr扩增香菇的dna；
19.s3、pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳；
20.s4、根据电泳条带的数量和长度判断香菇的交配型。
21.优选的，步骤s4的判断方法为，当扩增出179bp、256bp，2个条带，即为香菇杂交群体短菌龄菌株；当扩增出256bp处1条带，即为香菇杂交群体长菌龄菌株。
22.优选的，步骤s2中，pcr引物为：
23.seq id no.1：3
’‑
caagagctaacgaattctccca-5’；
24.seq id no.2：3
’‑
ccctttgcgcatggtactag-5’。
25.优选的，步骤s2中，pcr扩增条件为：94℃5min；94℃30s，48～55℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
26.优选的，用于鉴定香菇杂交群体菌龄的方法包括以下步骤：
27.步骤一、菌丝培养：将香菇菌丝转接到pda平板上，25℃下避光培养，10d后收集菌丝；
28.步骤二、基因组dna的提取：用ctab法提取上述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度为20～30ng/ul；
29.步骤三、indel分子标记的检测：对上述提取的dna对开发的indel标记进行pcr扩增：
30.pcr扩增体系：2
×
es premix taqtm 10μl，indel标记正向引物、反向引物(10μmol/l)各1μl，模板dna(20～30ng/μl)2μl，补ddh2o至20μl；pcr扩增条件：94℃5min；94℃30s，48～55℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min；10℃保存；
31.步骤四、电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物点样7ul于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1xtae，电压90v，电流300ma，功率100w，电泳5h，用凝胶成像系统拍照，分析结果；选用编号jlid-1的indel标记引物对香菇菌株进行pcr扩增，通过对照dna marker 2000可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，统计条带数量；
32.其中所述的indel位点位于香菇基因组的2号染色体，indel标记名称为chr2：4546550-4546814，标记位置为4546639-缺失77，正向引物3
’‑5’
为caagagctaacgaattctccca，反向引物3
’‑5’
为ccctttgcgcatggtactag，产物大小为256bp。
33.与现有技术相比，应用本发明的技术方案的有益效果及显著进步在于：本发明以香菇杂交育种群体为研究对象，综合利用混池重测序和生物信息学手段，对长菌龄、短菌龄优异标记位点进行开发，形成1对适用于香菇杂交群体菌龄早期筛选的indel标记和1个indel位点的基因型的等位基因特异性引物，以及该标记在判定香菇杂交群体杂交子菌龄及早期筛选的应用方法，利用该标记和判定方法能够快速鉴定香菇杂交群体长菌龄、短菌龄育种材料，检测准确性高，重复性好，检测效率高，操作性强，克服了现有技术只能在菌棒阶段凭借栽培经验判断的效率低下的问题，减少了大量的工作量及试验成本，实现在菌丝阶段就能进行香菇杂交群体长菌龄及短菌龄杂交子早期筛选的技术效果。
附图说明
34.为更清楚地说明本发明的技术方案，以下将对本发明的实施例使用的附图进行简单介绍。
35.图1为本发明实施例3的香菇杂交群体短菌龄菌株pcr扩增结果；
36.图2为本发明实施例4的香菇杂交群体长菌龄pcr扩增结果。
具体实施方式
37.以下结合具体实施例进一步说明本发明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
38.在本实施例中菌株和实验材料的来源如下：
39.菌株来源：931为高温、短菌龄栽培菌株，来源于国家食用菌工程技术研究中心；l135为低温、长菌龄栽培菌株，菌株来源于福建省三明真菌研究所；其短菌龄杂交子编号分别为：21、50、84、100、142、150、175、200、204、270、275、292、301、338、343、360、420、443、506、517、536、687、723、787、820、834、847、913、1134；长菌龄杂交子编号分别为：12、39、7194、104、162、194、235、260、268、276、281、308、330、367、408、444、454、467、478、629、713、880、1197。
40.marker、premix taq
tm
均购自：takala bio宝日生物科技有限公司。
41.核酸染料购自：北京全式金生物技术有限公司。
42.其余材料和试剂均为普通市售产品。
43.实施例1筛选indel标记
44.以香菇l135和931为亲本构建杂交群体，将杂交子菌棒分为三个菌龄时期进行出菇试验：第一批培养80d，第二批培养100d，第三批培养120d。根据三批栽培试验不同菌株从接种到原基形成(营养生长)天数、现蕾数量、单菇重和总产量综合计算菌龄时间。
45.随机选取长菌龄菌株(≧120d)30株，短菌龄菌株(≦80d)30株及中间菌龄菌株(80～120d)30株，进行bsa混池测序，双亲和子代重测序深度为30x，每个池测序5个g的数据。对原始测序数据进行过滤，去除含n比例大于10％的reads，移除带有接头和低质量的reads，
得到高质量reads。使用比对软件bwa(0.7.12)将高质量的reads比对到香菇参考基因组l808-1(genbank accession no.jabfyj000000000)。使用比对软件bwa(0.7.12)统计变异位点：首先使用软件gatk(3.4-46)的unified genotyper模块对多个样本的variant进行检测，然后使用variant filtration对检测到的变异进行过滤，最后对变异位点进行分析。通过重测序共获得47 362个多态性snp位点，取深度大于10的snp位点用于ed值的计算，为直观反映子代ed值在染色体上的分布情况，对snp的ed2值点在染色体上的分布进行作图。将ed值平方作图，可降低背景噪音的干扰。以1-10号染色体为横坐标，ed值作为纵坐标作图。用loess曲线拟合。结果显示：存在多个snp阈值峰区，且2号、4号、6号、7号、8号、9号染色体上峰区最为明显。
46.进一步与参考基因组比对，基于snp位点的缺失及比例的不同，定位到8个与菌龄相关的位点，分别位于2号染色体的3800000-5000000bp，4号染色体的106000-266000bp、1900000-2200000bp，6号染色体的0-4000000bp，7号染色体的2600000-2770000bp，8号染色体的2520000-2800000bp，9号染色体的930000-1020000bp、2400000-2440000bp。对上述8个位点的插入、缺失片段进行检测，共筛选到38个indel分子标记位点。
47.实施例2设计indel标记的引物
48.对上述实施例1中筛选到的38个indel分子标记位点进行引物设计。引物通过premier primer 5.0软件于indel位点两翼各200bp长度内进行设计，获得的引物序列由生工生物合成。
49.编号序列seq id no.13
’‑
caagagctaacgaattctccca-5’seq id no.23
’‑
ccctttgcgcatggtactag-5’50.实施例3采用indel标记对香菇杂交群体短菌龄杂交子及其亲本进行检测
51.对杂交群体短菌龄菌株及其亲本提取的dna进行pcr扩增，其中pcr反应条件如下：
52.pcr扩增体系：2
×
es premix taqtm 10μl，indel标记正向引物、反向引物(10μmol/l)各1μl，模板dna(20～30ng/μl)2μl，补ddh2o至20μl；pcr扩增条件：94℃5min；94℃30s，48～55℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min；10℃保存；
53.电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物点样7ul于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1xtae，电压90v，电流300ma，功率100w，电泳5h，用凝胶成像系统拍照，分析结果；
54.选用jlid-1的indel标记引物对香菇菌株进行pcr扩增，通过对照dna marker 2000可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，并统计条带数量。
55.其中indel位点为实施例1筛选的：的位于2号染色体，indel标记名称为chr2：4546550-4546814，标记位置为4546639-缺失77。
56.引物为实施例2设计的：正向引物3
’‑5’
为caagagctaacgaattctccca，反向引物3
’‑5’
为ccctttgcgcatggtactag，产物大小为256bp。
57.检测待检菌株的indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量；分别于179bp及256bp处有1条带，即为短菌龄菌株。
58.香菇杂交群体短菌龄菌株pcr扩增结果如下图1所示。29个杂交子中有24个菌株分别于179bp及256bp处各有1条带，统计为短菌龄菌株，有82.76％的菌株菌龄鉴定结果与前
期栽培法鉴定的菌龄结果一致。有17.24％的菌株菌龄鉴定结果与前期栽培法鉴定菌龄的结果不一致，这可能与前期栽培法鉴定菌龄时间的标准有关。本检测准确性较高，重复性好，检测效率高，操作性强，可以很大程度上减少香菇育种工作的时间及研发成本，克服了现有技术只能在菌棒阶段凭借栽培经验判断的效率低下的问题，具有很大的实际应用价值。
59.实施例4采用indel标记对香菇杂交群体长菌龄菌株及其亲本进行检测
60.对杂交群体长菌龄菌株及其亲本提取的dna进行pcr扩增，其中pcr反应条件如下：
61.pcr扩增体系：2
×
es premix taqtm 10μl，indel标记正向引物、反向引物(10μmol/l)各1μl，模板dna(20～30ng/μl)2μl，补ddh2o至20μl；pcr扩增条件：94℃5min；94℃30s，48～55℃45s，72℃30s，35个循环；72℃7min；10℃保存。
62.电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物点样7ul于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1xtae，电压90v，电流300ma，功率100w，电泳5h，用凝胶成像系统拍照，分析结果；
63.选用编号jlid-1的indel标记引物对香菇菌株进行pcr扩增，通过对照dna marker2000可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，并统计条带数量；
64.其中indel位点为实施例1筛选的：位于2号染色体，indel标记名称为chr2：4546550-4546814，标记位置为4546639-缺失77。
65.引物为实施例2设计的：正向引物3
’‑5’
为caagagctaacgaattctccca，反向引物3
’‑5’
为ccctttgcgcatggtactag，产物大小为256bp。
66.检测待检菌株的indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量；只于256bp处有1条带，即为长菌龄菌株。
67.香菇杂交群体长菌龄菌株pcr扩增结果如图2所示，24个杂交子中有17个菌株只于256bp处有1条带，统计为长菌龄菌株，有70.83％的菌株菌龄鉴定结果与前期栽培法鉴定的菌龄结果一致。有29.17％的菌株菌龄鉴定结果与前期栽培法鉴定菌龄的结果不一致，这可能与前期栽培法鉴定菌龄时间的标准有关。本分子标记检测具有较高的准确性，重复性好，检测效率高，操作性强，可以很大程度上减少香菇育种工作杂交群体筛选的时间及研发成本，克服了现有技术只能在菌棒阶段凭借栽培经验判断的效率低下的问题，具有很大的实际应用价值。
68.申请人声明，在上述说明书的描述过程中：
69.术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
70.最后应说明的是：
71.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
72.尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。