组合物及其用途的制作方法

1.本公开总体上涉及用于治疗猫科动物受试者，特别是患有贫血症或有患贫血症风险的猫科动物受试者的组合物和方法。
2.关于序列表的声明
3.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并据此通过引用并入说明书。包含此序列表的文本文件的名称为sctb-008-01wo_st25。该文本文件为14kb，创建于2021年9月24日，并以电子形式随同提交。
技术背景
4.红细胞生成素(epo)，也称为造血素(haematopoietin)或促血细胞生成素(haemopoietin)，是响应细胞缺氧而主要在肾的肾小管周细胞内产生的激素。epo也在肝脏中产生，主要是在胎儿和围产期期间产生，但在成人期主要由肾脏合成。其作用于骨髓，刺激红细胞生成，以补偿正常的红细胞更新(红细胞稳态)。红细胞生成素还控制成熟红细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。
5.肾病通常会减少epo的产生。在人中，重组人促红细胞生成素(epoetin)的开发使慢性肾病中贫血的治疗发生了革命性的变化。当贫血得到纠正时，许多归因于慢性肾病的症状(诸如疲劳、昏睡、嗜睡和气短，所述症状都对生活质量产生不利影响)得到解决或显著改善。epo还用于治疗由其它疾病(诸如骨髓增生异常)和化疗引起的贫血疾患。然而，存在与epo疗法相关的风险，包括心肌梗死、中风和静脉血栓栓塞。当epo治疗导致红细胞稳态紊乱或红细胞增多症即血红蛋白水平过高(人体内通常高于11-12g/dl)时，这些风险会增加。
6.贫血，包括由慢性肾病引起的贫血，也影响动物，包括猫科动物。有超过200万只猫患有慢性肾病(ckd)，注意到患有ckd相关肾衰竭的陪伴动物诸如猫和狗通常呈现与我们在人ckd中看到的相似的病理生理学特征，包括至少部分归因于epo水平不足的贫血。对患有贫血的陪伴动物的现有治疗包括施用人重组epo。然而，由于动物通常会对重组epo产生免疫反应，因此长期治疗通常是无效的。因此，仍然迫切需要改进的治疗方案，用于在有此需要的受试者中、特别是猫科动物中的epo长期递送。


技术实现要素：

7.在本文公开的一个方面，提供了一种用于促进患有贫血的猫科动物受试者的红细胞稳态的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用包含重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述重组腺相关病毒包含aav衣壳，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中以有效促进猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量向受试者施用所述组合物，其中所述剂量为约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，剂量为约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。
8.本公开还扩展至包含aav衣壳的重组腺相关病毒(raav)在制备用于在患有贫血的
猫科动物受试者中促进红细胞稳态的药物中的用途，其中aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中将raav配制成以有效促进猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量施用，其中所述剂量为约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，剂量为约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。
9.在本文公开的另一方面，提供了用于在患有贫血的猫科动物受试者中促进红细胞稳态的药物组合物，其中所述组合物包含重组腺相关病毒(raav)，所述重组腺相关病毒包含aav衣壳，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成以有效促进猫科动物受试者中的红细胞稳态的剂量施用，其中所述剂量为约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，剂量为约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。
10.本文所述的重组载体可用于治疗慢性肾病和以循环红细胞数量不足为特征的其它疾患(即贫血)的方案。
11.在本文公开的另一方面，提供了包含本文所述的重组腺相关病毒(raav)的单位剂型，其中该剂型以约1.0
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的量包含所述raav。
12.本发明还扩展至包含本文所述的组合物或剂型的药盒。
13.根据本发明的以下详细说明，本发明的其它方面和有利方面将显而易见。
附图说明
14.图1显示了表达猫科动物epo的aav1(aav1-epo)对正常实验室猫的血细胞比容(hct)的影响。以1.9
×
108、6.0
×
108、1.9
×
109和6.0
×
109个基因拷贝/kg体重(gc/kg；剂量组n＝6)施用aav1-epo。对照动物接受磷酸盐缓冲盐水(pbs)作为安慰剂。任何一只猫的hct的最大增加是15点(％)。在正常健康的猫中，剂量1.9
×
109和6.0
×
109gc/kg显示了群体平均hct的显著且持续的增加。与安慰剂相比，1.9
×
108gc/kg和6.0
×
108gc/kg对平均hct没有任何显著影响。y轴
–
血细胞比容(hct％)；x轴-aav1-epo施用后的天数。
15.图2显示了3.0
×
109gc/kg的aav1-epo对患有ckd相关贫血的三只猫的血细胞比容(hct)的影响。y轴
–
血细胞比容(hct％)；x轴-在第0天施用aav1-epo后的天数。
16.图3显示了在以约2.0
×
108至约6.0
×
108gc/kg的剂量范围施用aav1-epo后，ckd相关贫血猫中的红细胞稳态。接受aav1-epo治疗的猫均不需要针对红细胞增多症进行治疗。y轴
–
血细胞比容或红细胞压积(packed cell volume)(pcv％)。x轴-在第0天(基线)施用aav1-epo后的天数。*与基线相比的p《0.05(配对t检验)；误差棒表示标准偏差；在指定的时间点分别是n＝15、15、14、13、10、9。
17.图4显示了猫科动物epo的一个示例性氨基酸序列(seq id no:1)。前导序列带有下划线。编码seq id no:1的猫科动物epo前蛋白的经密码子优化的核苷酸序列显示在seq id no:2中。用于产生病毒载体的表达盒示于seq id no:3中，所述表达盒包含猫科动物epo构建体序列以及侧翼的病毒基因组包装信号和其它表达控制序列。
18.图5显示了编码猫科动物epo前蛋白(genbank登录号afn85670.1)、鸡β-肌动蛋白启动子和部分cmv立即早期增强子的aav1-猫科动物epo表达载体。表达构建体两侧为5’和3’aav反向末端重复序列(itr)。然后通过三重转染和碘克沙醇梯度纯化将猫科动物epo表
达构建体包装在aav血清型1(aav1)衣壳中，并通过taqman定量pcr进行滴定。
19.图6显示了用sb-001治疗的猫(从诊断为4期慢性肾病到死亡)的存活期(n＝9)。中位存活时间为64天。
具体实施方式
20.本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，无意进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。类似于或等同于本文所述的材料和方法的任何材料和方法都可以用于实施本发明。关于本领域技术人员已知的现有技术和其它方法的定义和术语，从业者可参考sambrook等人(1989)molecular cloning:a laboratory manual，第2版，cold spring harbor press,plainsview,n.y.，以及ausubel等人(1999)current protocols in molecular biology(supplement 47),john wiley&sons,new york,murphy等人(1995)virus taxonomy springer verlag:79-87。
21.如本文中所用，术语“约”是指相对于参考数量、水平、值、尺寸、大小或数量变化多达10％(例如10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的数量、水平、值、尺寸、大小或量。
22.在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或变型诸如“包括”或“具有”等，将被理解为包括所述元素或整体或者元素或整体的组，但不排除任何其它元素或整体或者元素或整体的组。
[0023]“由......组成”意指包括并仅限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的元素是必需的或强制的，并且不可以存在其它元素。“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于本公开内容中针对所列元素指定的活性或动作的其它元素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的元素是必需的或强制性的，但是其它元素是可选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列出的元素的活性或动作。
[0024]
如本文中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数方面。例如，提及“一个/种载体(a vector)”包括单个/种载体，以及两个/种或更多个/种载体；提及“一个/种细胞(a cell)”包括一个/种细胞，以及两个/种或更多个/种细胞；诸如此类。
[0025]
核苷酸和氨基酸序列用序列标识号(seq id no:)表示。seq id no在数字上对应于序列标识符《400》1、《400》2等。本文提供了序列标识符的概述。
[0026]
本发明至少部分基于本发明人的惊人发现，即适于驱动重组猫科动物epo表达且原本足以增加健康猫科动物受试者中的血细胞比容或红细胞压积的腺病毒载体的剂量对患有贫血的猫科动物受试者出乎意料地是有害的或致命的。本发明人意外地发现，当以预期不会增加健康猫科动物受试者的血细胞比容或红细胞压积的较低剂量向贫血猫科动物受试者施用表达猫科动物epo的腺病毒载体时，仍然可以在贫血猫科动物受试者中恢复红细胞稳态。有利的是，本发明人还发现本文所述的低剂量治疗方案将贫血动物中红细胞增多症的风险降至最低。
[0027]
因此，在本文公开的一个方面，提供了用于促进患有贫血的猫科动物受试者的红
细胞稳态的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用包含含有aav衣壳的重组腺相关病毒(raav)的组合物，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物促红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在所述受试者中的表达的表达控制序列，其中以有效促进所述猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量向所述受试者施用所述组合物，其中所述剂量为约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。
[0028]
红细胞稳态
[0029]
如本文中所用，短语“红细胞稳态”是指受试者体内循环红细胞水平的生理维持，该水平被理解为在该物种的健康受试者的可接受或正常限度内。例如，在猫科动物受试者中，循环红细胞的正常水平通常在约28.2％至约50％(血细胞比容或红细胞压积)的范围内。
[0030]
血细胞比容计算为平均细胞体积(mcv)与红细胞(rbc)计数的乘积，两者均可通过合适的分析仪直接测量，其中hct＝(mcv x rbc计数)
÷
10。可能错误地增加或减少mcv(例如rbc的储存可导致rbc膨胀，mcv增加)或红细胞计数(例如溶血)的因素会影响hct，但不一定影响pcv。红细胞压积(pcv)通常通过在微量血细胞比容离心机中对微量血细胞比容管中的血液样品离心来测量，并被作为离心后微量血细胞比容管中红细胞柱的高度占样品总高度的百分比。与hct不同，pcv测量可能会受到血浆捕集和红细胞在柱中的堆积方式的影响。hct和pcv都表示为占血液的百分比(si单位通常为l/l)；即，％
÷
100＝l/l。关于正常(健康)猫科动物受试者的hct/pcv值有不同的报道，尽管这些值通常在约28.2％至约50％的范围内。相比之下，贫血的猫科动物受试者通常具有低于28.2％的hct/pcv。
[0031]
贫血通常被定义为红细胞或血红蛋白的数量或质量的缺乏。贫血是由许多不同的因素引起的，其实例包括失血(例如外伤和胃肠出血)、红细胞生成减少(例如缺铁、维生素b12缺乏、营养不良、地中海贫血和骨髓肿瘤)和红细胞分解增加(例如遗传疾患诸如凝血病、寄生虫感染(例如跳蚤、蜱、钩虫、猫支原体(mycoplasma haemofelis))和自身免疫性疾病)。在本文公开的一个实施方案中，猫科动物受试者的特征是贫血(即，为患有贫血)，其中猫科动物受试者的血细胞比容或红细胞压积小于约29％，优选小于约28.2％ pcv。在一个实施方案中，患有贫血的猫科动物受试者的pcv为约28％或更低。在又一另外的实施方案中，患有贫血的猫科动物受试者的pcv在约10％至约28％的范围内。在一个实施方案中，患有贫血的猫科动物受试者的pcv在约22％至约28％的范围内。在一个实施方案中，患有贫血的猫科动物受试者的pcv为约22.5％。
[0032]
在一个实施方案中，贫血至少部分归因于药物的使用，其说明性实例包括fiv/猫科动物aids治疗和癌症疗法，包括化疗。在一个实施方案中，贫血至少部分归因于医学疾患，其说明性实例包括癌症、fiv/aids、类风湿性关节炎、克罗恩病和其它慢性炎性疾病和功能障碍性骨髓(例如再生障碍性贫血、白血病、骨髓发育异常或骨髓纤维化)、多发性骨髓瘤、骨髓增殖性病症和淋巴瘤、溶血性贫血、镰状细胞性贫血和地中海贫血。在一个实施方案中，贫血归因于慢性肾病。在一个实施方案中，贫血与慢性肾病相关。
[0033]
在一些实施方案中，可能需要治疗有患贫血症风险的猫科动物受试者，例如，其中猫科动物受试者已被诊断出患有可能促进贫血症状态但另外地hct/pcv在正常范围内的疾病或疾患。在这些情况下，本文所述的方法可用于预防贫血，或者一旦猫科动物受试者变为贫血，本文所述的方法可恢复红细胞稳态。因此，本文还涵盖一种用于在处于发生贫血风险
中的猫科动物受试者中促进红细胞稳态的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用包含重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述重组腺相关病毒包含aav衣壳，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中所述组合物以在猫科动物受试者中有效促进红细胞稳态的剂量向受试者施用，其中所述剂量为约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。
[0034]
本领域技术人员将理解，本文所述的方法将促进(即恢复)猫科动物受试者的红细胞稳态，其中在施用所述aav载体后，受试者中hct/pvc的增加达到该物种的健康受试者的可接受或正常范围内的值。
[0035]
在一个实施方案中，该剂量有效地将猫科动物受试者的pcv增加约5至约30个pcv点到施用组合物后第70天。在另一个实施方案中，该剂量有效地将猫科动物受试者的pcv增加约10至约20个pcv点到施用组合物后第70天。在另一个实施方案中，该剂量有效地将猫科动物受试者的pcv增加约15个pcv点到施用组合物后第70天。
[0036]
在一个实施方案中，该剂量有效地将猫科动物受试者的pcv增加至约30％至约55％的值到施用组合物后第70天。在另一个实施方案中，该剂量有效地将猫科动物受试者的pcv增加至约30％至约35％的值，到施用组合物后第70天。在又一另外的实施方案中，该剂量有效地将猫科动物受试者的pcv增加至约33％至约35％的值，到施用组合物后的第70天。
[0037]
如本文其它地方所述，本发明人惊奇地发现，本文所述的剂量方案能够促进或以其它方式恢复红细胞稳态，同时避免红细胞增多症(过多或异常高的红细胞水平)。因此，在一个实施方案中，到施用组合物后第70天，猫科动物受试者没有出现红细胞增多症。在另一个实施方案中，猫科动物受试者不需要对红细胞增多症进行治疗，优选到施用组合物后第70天不需要对红细胞增多症进行治疗。
[0038]
在一个实施方案中，以约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更少的单位剂量向猫科动物受试者肌内施用所述组合物。在一个实施方案中，以约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更少的单位剂量向猫科动物受试者肌内施用所述组合物。在一个实施方案中，以约1.0
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的单位剂量向猫科动物受试者肌内施用所述组合物。在一个实施方案中，以约1.2
×
109至约5.0
×
109基因组拷贝的单位剂量向猫科动物受试者肌内施用组合物。
[0039]
本发明还扩展至包含aav衣壳的重组腺相关病毒(raav)在制备用于促进患有贫血的猫科动物受试者的红细胞稳态的药物中的用途，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在所述受试者中的表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成以有效促进猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量施用，其中所述剂量为约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，剂量为约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，将组合物配制成以约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。在一个实施方案中，将组合物配制成以约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。在一个实施方案中，将组合物配制成以约1.0
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。在一个实施方案中，将组合物配制成以约1.2
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。
[0040]
在本文公开的另一方面，提供了用于促进患有贫血的猫科动物受试者的红细胞稳态的药物组合物，其中所述组合物包含含有aav衣壳的重组腺相关病毒(raav),其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成以有效促进猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量施用，其中所述剂量为约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，剂量为约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低。在一个实施方案中，将组合物配制成以约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。在一个实施方案中，将组合物配制成以约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更低的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。在一个实施方案中，将组合物配制成以约1.0
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。在一个实施方案中，将组合物配制成以约1.2
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的单位剂量肌内施用于猫科动物受试者。
[0041]
在本文公开的另一方面，提供了治疗患有慢性肾病的贫血的猫科动物受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述重组腺相关病毒包含aav1衣壳，其中aav1衣壳包含编码具有seq id no:1的氨基酸序列的猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列，以及指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中所述组合物(i)以约3.65
×
109个基因组拷贝的剂量向体重为2至6kg的猫科动物受试者肌内施用，或(ii)以约7.30
×
109个基因组拷贝的剂量向体重超过6kg的猫科动物受试者肌内施用。
[0042]
在本文公开的另一方面，提供了包含aav1衣壳的重组腺相关病毒(raav)在制备用于治疗患有慢性肾病的贫血猫科动物受试者的药物中的用途，其中所述aav1衣壳包含编码具有seq id no:1的氨基酸序列的猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列，和指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成(i)以约3.65
×
109个基因组拷贝的剂量肌内施用于体重为2至6kg的猫科动物受试者，或(ii)以约7.30
×
109个基因组拷贝的剂量肌内施用于体重超过6kg的猫科动物受试者。
[0043]
在本文公开的另一方面，提供了用于治疗患有慢性肾病的贫血猫科动物受试者的药物组合物，其中所述组合物包含含有aav1衣壳的重组腺相关病毒(raav)，其中所述aav1衣壳包含编码具有seq id no:1的氨基酸序列的猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列，和指导受试者中epo表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成以(i)约3.65
×
109个基因组拷贝的剂量肌内施用于体重为2至6kg的猫科动物受试者，或以(ii)约7.30
×
109个基因组拷贝的剂量肌内施用于体重超过6kg的猫科动物受试者。
[0044]
在本文公开的另一个方面，提供了治疗患有慢性肾病的贫血猫科动物受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述重组腺相关病毒包含aav1衣壳，其中所述aav1衣壳包含编码具有seq id no:1的氨基酸序列的猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列，以及指导epo在受试者中的表达的表达控制序列，其中以(i)约3.65
×
109个基因组拷贝的剂量向体重为2至6kg的猫科动物受试者肌内施用所述组合物，或以(ii)约7.30
×
109个基因组拷贝的剂量(以两个剂量的形式施用，每个剂量包含约3.65
×
109个基因组拷贝)向体重超过6kg的猫科动物受试者肌内施用所述组合物。
[0045]
在本文公开的另一方面，提供了包含aav1衣壳的重组腺相关病毒(raav)在制备用于治疗患有慢性肾病的贫血猫科动物受试者的药物中的用途，其中aav1衣壳包含编码具有
seq id no:1的氨基酸序列的猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列，和指导受试者中epo表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成以(i)约3.65
×
109个基因组拷贝的剂量肌内施用于体重为2至6kg的猫科动物受试者，或以(ii)约7.30
×
109个基因组拷贝的剂量(以两个剂量的形式施用，每个剂量包含约3.65
×
109个基因组拷贝)肌内施用于体重超过6kg的猫科动物受试者。
[0046]
在本文公开的另一方面，提供了用于治疗患有慢性肾病的贫血猫科动物受试者的药物组合物，其中所述组合物包含重组腺相关病毒(raav)，所述重组腺相关病毒包含aav1衣壳，其中所述aav1衣壳包含编码具有seq id no:1的氨基酸序列的猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列，以及指导epo在所述受试者中的表达的表达控制序列，其中将所述raav配制成以(i)约3.65
×
109个基因组拷贝的剂量肌内施用于体重为2至6kg的猫科动物受试者，或以(ii)约7.30
×
109个基因组拷贝的剂量(以两个剂量的形式施用，每个剂量包含约3.65
×
109个基因组拷贝)施用于体重超过6kg的猫科动物受试者。
[0047]
红细胞生成素(epo)
[0048]
epo是主要在肾脏中产生的糖蛋白激素。人epo是高度糖基化的，分子量约为30kda，其中40％源自其碳水化合物组分。epo促进epo依赖性集落形成单位红系(cfu-e)细胞和尚未开始合成血红蛋白的幼红细胞的存活。配体结合后，缺乏内在催化功能且为缺氧诱导型的epo受体(epor)与酪氨酸激酶janus激酶2(jak2)缔合，这进而磷酸化epor并为包含src同源区2(sh2)结构域的信号转导蛋白提供多个对接位点(docking site)。epor的信号传导通过多种途径发生，所述途径包括信号转导和转录激活因子(stat)5途径、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶b(pi-3k/akt)和丝裂原相关蛋白激酶/胞外信号相关激酶(mapk/erk)途径，以及蛋白激酶c。负反馈系统(其中组织氧合控制epo产生，epo控制红细胞(rbc)产生)在向身体组织的氧递送中提供稳态(koury和bondurant，11991；am j kidney dis.；18(4增刊1):20-3)。虽然epo可对早期红系祖细胞的有丝分裂有一定影响，但其对rbc产生的控制似乎发生在红系细胞发育的后期，在此阶段其防止程序性细胞死亡。
[0049]
如h.franklin bunn在2013年的论文"erythropoietin"(cold spring harb perspect med.；3(3):a011619)中所指出的，红细胞生成通常在人和其它哺乳动物中以低基础速率进行，用年轻的网织红细胞替代衰老的红细胞。在人中，在包括出血、溶血和其它类型的损害动脉血氧合或向组织的氧气递送的应激在内的各种临床情况下，红细胞的产生可被增强至基线水平的八倍。在胎儿发育期间，epo主要在肝脏中产生，而出生后，肾脏占epo产生的80％。
[0050]
人epo信使rna(mrna)编码193个残基的多肽。在内质网中典型前导序列的切割和翻译后糖基化之后，释放出166个残基的多肽。rhepo的一级结构经显示与内源激素的一级结构相同，不同之处在于c-末端精氨酸残基的体内翻译后切割。epo在血浆中循环(其中血浆半衰期约为7-8小时)并与以相对少的数量(约1000个/细胞)存在于骨髓中红系祖细胞(cfue)表面上的高亲和力(～100pm)受体结合。
[0051]
epo在体内表达为前肽或前体蛋白，其中前导序列在不同物种间共享同源性(参见例如wen等人(1993),blood,82(5):1507-1516)。猫科动物epo的氨基酸和核苷酸序列是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例描述于genbank登录号nm_001009269、u00685、afn85670、aaa18282、wen等人(1993,blood,82(5):1507-1516),walker等人(2005,ajvr,66
(3):450-456),beall等人(2000，gene therapy，7:534-539)和wo 2017/040524，各参考文献的内容通过引用以其整体并入本文中。
[0052]
在一个实施方案中，编码猫科动物epo的核酸序列编码猫科动物epo前蛋白，所述猫科动物epo前蛋白包含seq id no:1的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列、由其组成或基本由其组成的。seq id no:1的猫科动物epo前蛋白序列示于图4中，需要注意的是成熟的猫科动物epo蛋白开始于seq id no:1的氨基酸位置27。
[0053]
在一个实施方案中，猫科动物epo由核酸序列编码，所述核酸序列包含seq id no:2的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，由所述序列组成，或基本上由所述序列组成。
[0054]
在一个实施方案中，用于产生病毒载体的表达盒包含两侧为病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列的猫科动物epo构建体序列，所述猫科动物epo构建体序列包含seq id no:3的核酸序列，由所述核酸序列组成或基本由所述核酸序列组成。
[0055]
在一个实施方案中，表达盒由核酸序列编码，所述核酸序列包含seq id no:3的核酸序列或与其具有至少70％序列同一性的核苷酸序列、由其组成或基本由其组成。
[0056]
在一个实施方案中，猫科动物epo是全长猫科动物epo蛋白。“全长”意指由本文所述的核酸序列编码的猫科动物epo包含与天然猫科动物epo蛋白(即与天然存在的猫科动物epo蛋白)共享100％序列同一性的氨基酸序列。
[0057]
本文还设想了猫科动物epo的功能性变体。如本文中所用，术语“功能性变体”是指与天然猫epo共享至少一定序列同一性，同时还保留至少一些通常归于天然猫科动物epo蛋白的生物活性(诸如增加体内红细胞生成的能力)的氨基酸序列。因此，功能性变体可适当地扩展至天然猫科动物epo蛋白的功能性片段。如本文中所述，鉴定猫科动物epo功能性变体的方法是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例描述于本文其它地方。
[0058]
在一个实施方案中，epo的功能性变体包括与本文所述或本领域已知的epo核酸或氨基酸序列相比可包含高达约10％的变异的变体，所述变体保留了野生型序列的功能。如本文中所用,“保留功能”意指核酸或氨基酸以与野生型序列相同的方式发挥功能，尽管不一定处于相同的表达或活性水平。例如，在一个实施方案中，与野生型序列相比，功能性变体具有增加的表达或活性。在另一个实施方案中，与野生型序列相比，功能性变体具有降低的表达或活性。在一个实施方案中，与野生型序列相比，功能性变体的表达或活性增加或减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
[0059]
在另一个实施方案中，epo的功能性变体包括与本文所述或本领域已知的epo核酸或氨基酸序列相比可包括多达约20％的变异的变体，所述变体保留了野生型序列的功能。在一个实施方案中，epo的功能性变体包括与本文所述或本领域已知的epo核酸或氨基酸序列相比可包括多达约30％的变异的变体，所述变体保留了野生型序列的功能。
[0060]
在一个实施方案中，猫科动物epo包含seq id no:1的氨基酸序列或与其具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选至少93％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％或优选100％序列同一性的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。
[0061]
在一个实施方案中，猫科动物epo序列由seq id no:2的核酸序列或与其具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选至少93％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％或优选100％序列同一性的核酸序列编码。
[0062]
在一个实施方案中，用于产生病毒载体的表达盒由seq id no:3的核酸序列或与其具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选至少93％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％或优选100％序列同一性的核酸序列编码，所述病毒载体包含两侧为病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列的猫科动物epo构建体序列。
[0063]
如本文中所用，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等指核酸提供另一核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列能够被转录和/或翻译(通常在宿主细胞中)以产生多肽，或者如果其能够被加工成能够被转录和/或翻译以产生多肽的形式，则称该核酸序列“编码”多肽。这种核酸序列可包括编码序列或编码序列和非编码序列。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等包括由dna分子转录产生的rna产物、由rna分子翻译产生的蛋白质、由dna分子转录形成rna产物并随后翻译该rna产物产生的蛋白质、或由dna分子转录提供rna产物、加工该rna产物以提供经加工的rna产物(例如mrna)并随后翻译该经加工的rna产物产生的蛋白质。
[0064]“至少70％”包括在最佳比对或最佳拟合分析后与所提及的序列(包括seq id no:1、2和3)中的任一个具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0065]
用于比对比较窗口的序列的最佳比对可通过算法的计算机化实施(wisconsin genetics software package release 7.0中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group,575science drive madison,wi,usa)或通过检查和由本领域技术人员已知的任何合适方法产生的最佳比对(即，在比较窗内产生最高百分比同源性)来进行。也可以参考例如altschul等人(1997)nucl.acids.res.25:3389公开的blast系列程序。序列分析的详细论述也可见于ausubel等人(1994-1998)in:current protocols in molecular biology,john wiley&sons inc的单元19.3中。
[0066]
如本文中所用，术语“序列同一性”是指序列在比较窗内在逐个核苷酸或逐个氨基酸的基础上相同或结构相似的程度。例如，可通过确定它们的“同一性百分比”来比较两个或更多个肽序列。两个序列的同一性百分比可被描述为在两个比对的序列之间精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对通过smith和waterman，advances in applied mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。该算法可被扩展到使用dayhoff(atlas of protein sequences and structure,m.o.dayhoff编辑，增刊5 3:353-358,national biomedical research foundation,washington,d.c.,usa)开发、并由gribskov(nucl.acids res.14(6):6745-6763(1986))标准化的评分矩阵用于肽序列。用于对两个或更多个氨基酸序列进行比对并确定它们的序列同一性或同源性的合适
方法和计算机程序是本领域技术人员熟知的。例如，使用算法，例如blast、fasta或smith-waterman算法，可以容易地计算两个氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。因此，“序列同一性百分比”可通过以下过程来计算：在比较窗内比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中相同核酸碱基(例如a、t、c、g、i)或相同氨基酸残基(例如ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)出现的位置数量，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。例如，“序列同一性”是使用软件随附的参考手册中使用的标准默认值通过dnasis计算机程序(windows 2.5版；可从hitachi software engineering co.,ltd.,south san francisco,california,usa获得)计算的“匹配百分比”。
[0067]
如本文中所用，术语“序列同一性”包括比较序列之间在核苷酸或氨基酸水平上的精确同一性。如本文中所述，序列同一性通常涉及在比对序列并引入缺口(如有必要)以获得最大百分比同源性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与相应肽序列的残基相同的氨基酸残基的百分比。n末端或c末端延伸和插入都不应被解释为降低序列同一性或同源性。
[0068]
本公开还扩展至序列在核苷酸或氨基酸水平上的非精确同一性(即，相似性)，其中序列之间的任何差异都与在结构、功能、生物化学和/或构象水平上仍然彼此相关的氨基酸(或在核苷酸的情况下，由所述核苷酸编码的氨基酸)相关。例如，当在氨基酸水平上存在非同一性(相似性)时，“相似性”包括在结构、功能、生物化学和/或构象水平上仍然彼此相关的氨基酸。在一个实施方案中，核苷酸和序列的比较是在同一性而不是相似性的水平上进行的。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸残基。这可以被称为保守取代。在一个实施方案中，氨基酸序列可通过其中包含的任何氨基酸残基的保守取代来修饰，使得与未修饰的多肽相比，该修饰对经修饰的多肽的功能活性没有影响或影响可忽略。
[0069]
在本文公开的一个实施方案中，核酸序列是经密码子优化的。
[0070]
在一个实施方案中，猫科动物epo包含与猫科动物epo蛋白具有至少70％序列同一性、但仍保留与野生型猫科动物epo蛋白相同或基本上相同的功能的功能性变体，由所述功能性变体组成或基本上由所述功能性变体组成。在一些实施方案中，猫科动物epo变体所基于的序列可包括前肽前导序列(例如如seq id no:1所示的；图4)。在另一个实施方案中，本文所述的猫科动物epo变体仅包含成熟肽(例如seq id no:1的氨基酸残基27-192)，由所述成熟肽组成或基本由所述成熟肽组成。如本文中所用，术语“保留功能”意指功能性变体以与野生型猫科动物epo蛋白相同或基本上相同的方式发挥作用，尽管表达或活性水平不一定相同。例如，与野生型猫科动物epo蛋白相比，功能性变体可具有增加的表达或活性。或者，与野生型猫科动物epo序列相比，功能性变体可具有降低的表达或活性。在一个实施方案中，功能变体具有野生型猫科动物epo蛋白的表达或活性的至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％或更优选至少95％。
[0071]
在本文公开的一个实施方案中，编码猫科动物epo的核酸序列包含异源前导序列。当用于指氨基酸或核酸序列时，术语“异源的”通常表示该氨基酸或核酸序列包含在自然界中彼此之间未以相同关系存在的两个或更多个序列或子序列。例如，表达盒通常是重组产
生的，具有来自不相关基因的排列成产生新的功能性核酸的两个或更多个序列。在一个实施方案中，前导序列可来自不同的基因；也就是说，不同于编码epo的基因。在另一个实施方案中，前导序列来自除猫科动物外的物种。合适的前导序列是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括细胞因子(例如il-2、il12、il18)、免疫球蛋白、胰岛素、白蛋白、β-葡糖醛酸酶、碱性蛋白酶、纤连蛋白分泌信号肽的信号序列，或来自组织特异性分泌蛋白的序列。在一个实施方案中，前导序列编码il-2信号肽(例如seq id no:4：m y r m q l l s c i a l s l a l v t n s)。在一个实施方案中，前导序列是来自epo前肽的内源前导序列(例如seq id no:1的氨基酸残基1-26)。
[0072]
术语“衍生的”或“衍生自”在本文中可互换使用，表示序列(氨基酸或核苷酸序列)来源于猫科动物受试者，或与来源于猫科动物受试者的蛋白质或核苷酸序列具有相同的序列。例如,“衍生自”猫科动物的前肽序列可与在猫科动物中表达的相同前肽序列共享相同的序列(或其功能变体，如本文所定义的)。然而，指定的核酸或氨基酸实际上不需要来源于猫科动物。本领域技术人员将知道可用于产生所需序列的各种技术，包括类似蛋白质(例如同源物)的诱变或核酸或氨基酸序列的人工(重组)产生。无论衍生序列的实际来源如何，衍生的核酸或氨基酸通常保持其所衍生自的物种中的相同核酸或氨基酸的相同或基本相同的功能。
[0073]
本发明还扩展至其中对野生型猫科动物epo序列(例如seq id no:1)进行了一个或多个氨基酸取代的猫科动物epo的功能性变体。在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括一个或多个保守氨基酸取代，其说明性实例描述于本文其它地方。
[0074]
术语“氨基酸取代”等旨在涵盖通过用另一个取代氨基酸残基替换氨基酸而对氨基酸序列进行的修饰。该取代可以是保守氨基酸取代，如本文其它地方所描述的。在一些实施方案中，取代可以是非保守取代。术语“保守的”在指两个氨基酸时，旨在指氨基酸共享本领域技术人员公认的共同特性。例如，具有疏水性非酸性侧链的氨基酸、具有疏水性酸性侧链的氨基酸、具有亲水性非酸性侧链的氨基酸、具有亲水性酸性侧链的氨基酸和具有亲水性碱性侧链的氨基酸。共同特性也可以是具有疏水性侧链的氨基酸、具有脂族疏水性侧链的氨基酸、具有芳族疏水性侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有带电荷的侧链的氨基酸、具有带电荷的酸性侧链的氨基酸和具有带电荷的碱性侧链的氨基酸。天然存在和非自然存在的氨基酸都是本领域已知的，并且可在一个实施方案中用作取代氨基酸。替换氨基酸的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于编码氨基酸序列的核苷酸序列的突变。
[0075]
本文提及的“一个或多个”旨在涵盖例如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个的单独实施方案。
[0076]
如本文其它地方所述，可对编码猫科动物epo的核酸序列进行密码子优化。例如，当需要猫科动物epo肽的功能性变体时，可使用野生型核酸序列的定点诱变来产生这些功能性变体的编码序列。基于网络或商购可得的计算机程序，以及基于服务的公司可用于将氨基酸序列反向翻译成核酸编码序列，包括rna和/或cdna。参见例如emboss的backtranseq,http://www.ebi.ac.uk/tools/st/；gene infinity(http://www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html)；expasy(http://www.expasy.org/tools/)。在一个实施方案中，rna和/或cdna编码序列被设计用于在最终
打算对其施用的受试物种中进行最佳表达，如本文中所论述的。因此，在一个实施方案中，编码序列被设计用于在猫科动物中进行最佳表达。
[0077]
可使用密码子优化设计编码序列用于最佳表达。经密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法来设计。这种优化可使用可在线获得的方法、公开的方法或提供密码子优化服务的公司来进行。例如，在国际专利公布第wo 2015/012924号(其通过引用并入本文)中描述了一种密码子优化方法。简言之，用同义密码子序列修饰编码产物的核酸序列。合适地，修饰产物的开放阅读框(orf)的全长。然而，在一些实施方案中，可能只有orf的一个片段被改变。通过使用这些方法中的一种，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生编码多肽的经密码子优化的编码区的核酸片段。
[0078]
在一个实施方案中，编码epo的核酸序列是编码本文所述的任何epo肽的经密码子优化的序列，包括与所述序列共享至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，对核酸序列进行密码子优化，以便在需要施用其的受试者中表达。
[0079]
腺相关病毒载体
[0080]
携带猫epo表达构建体的腺相关病毒载体已被开发用于猫科动物受试者。当与用于在受感染的动物中表达重组epo的病毒载体介导的系统相比时，作为治疗剂的重组猫科动物epo蛋白的开发和生产成本过高。病毒载体治疗剂还具有方便的有利方面，因为治疗受试者只需要单次施用或较低剂量，而不需要反复施用重组epo蛋白，从而进一步改善生活质量。本文所述的epo构建体适宜地提供对待治疗的猫科动物受试者而言天然的epo序列，因为这通常会降低或以其它方式避免受试者对非天然epo蛋白产生免疫反应的风险。
[0081]“载体”和“构建体”可互换使用，意指其中可插入或克隆编码猫科动物epo的核酸序列的核酸分子，优选dna分子，例如衍生自质粒、噬菌体或病毒。载体优选包含一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在确定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或者祖细胞或其组织)中自主复制，或者可以与确定的宿主的基因组整合，使得克隆的序列是可复制的。因此，所述载体或构建体可以是自主复制载体(即，作为染色体外实体存在的载体)，其复制不依赖于染色体复制(例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。载体可包含任何确保自我复制的工具。或者，载体可以是这样一种载体，当其被引入宿主细胞时，被整合到基因组中，并与其所整合进的染色体一起复制。载体系统可包含单个载体或质粒，两个或更多个载体或质粒，它们一起包含将被引入宿主细胞基因组的总dna，或转座子。载体的选择通常取决于载体与载体将被引入的宿主细胞的相容性。载体还可包括选择标记，诸如抗生素抗性基因，其可用于选择合适的转化体。此类抗性基因的实例为本领域技术人员所熟悉的。
[0082]
在一个实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(aav)载体，其使得重组猫科动物epo能够在受试者中持续表达。
[0083]
腺相关病毒是细小病毒科的成员，包含少于约5,000个核苷酸的线性单链dna基因组。为了高效复制，aav需要与辅助病毒(即，腺病毒或疱疹病毒)共感染，或表达辅助基因。用于治疗性核酸施用的aav载体通常被缺失了约96％的亲代基因组，从而仅保留末端重复序列(itr)，其包含用于dna复制和包装的识别信号。这消除了由于病毒基因表达而引起的免疫或毒副作用。另外，如果需要，将特定的aav蛋白递送至生产细胞使得能够将包含aav itr的aav载体整合至细胞基因组的特定区域(参见例如美国专利第6,342,390号和6,821,
511号)。包含整合的aav基因组的宿主细胞在细胞生长或形态学方面未显示出变化(参见例如美国专利第4,797,368号)。
[0084]
aav itr位于非结构复制(rep)蛋白和结构衣壳(cap)蛋白(也称为病毒体蛋白(vp))的独特编码核苷酸序列的两侧。末端145个核苷酸是自身互补的并且被组织成使得可以形成t形发夹的能量稳定的分子内双链体。这些发夹结构通过充当细胞dna聚合酶复合物的引物而作为病毒dna复制的起点。rep基因编码rep蛋白rep78、rep68、rep52和rep40。rep78和rep68从p5启动子转录，rep 52和rep40从p19启动子转录。rep78和rep68蛋白是多功能dna结合蛋白，其在生产性复制期间执行解旋酶和切刻酶功能，以允许aav末端解开(参见例如im等人，cell,61:447-57(1990))。这些蛋白质也调节从内源aav启动子和辅助病毒内的启动子的转录(参见例如pereira等人，j.virol.,71:1079-1088(1997))。其它rep蛋白修饰rep78和rep68的功能。cap基因编码衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。cap基因从p40启动子转录。
[0085]
本文还公开了包含编码本文所述epo分子的核酸序列的表达构建体，所述核酸序列与一个或多个调控序列可操作地连接。
[0086]
如本文中所用，术语“epo构建体”、“epo表达构建体”和同义词包括本文所述的epo序列。术语“epo构建体”、“epo表达构建体”及其同义词可用于指编码epo(包括epo成熟蛋白或具有内源或异源前导序列的前肽)或其表达产物的核酸序列。
[0087]
术语“构建体”也用于表示包括来自不同来源的一种或多种分离的核酸序列的重组遗传分子。因此，构建体是嵌合分子，其中两种或更多种不同来源的核酸序列被组装成单个核酸分子，并且包括任何构建体，所述构建体包含(1)核酸序列，包括在自然界中不一起存在的调控和编码序列(即，核苷酸序列中的至少一个相对于其的其它核苷酸序列中的至少一个是异源的))，或(2)编码非天然邻接的功能性rna分子或蛋白质的部分的序列，或(3)非天然邻接的启动子的部分。代表性构建体包括任何重组核酸分子，诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状单链或双链dna或rna核酸分子，其衍生自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含其中一个或多个核酸分子已经可操作地连接的核酸分子。合适的构建体通常包括指导也包含在构建体中的目标核酸序列表达(例如靶核酸序列或调节核酸序列)的必需元件。此类元件可包括控制元件或调控序列，诸如与目标核酸序列可操作地连接(以便指导其转录)的启动子，并且通常还包括多聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方案中，构建体可包含在载体中。除了构建体的组件之外，载体还可包括例如一个或多个选择性标记、一个或多个复制起点(诸如原核和真核起点)、至少一个多克隆位点和/或促进构建体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件。两个或更多个构建体可包含在单个核酸分子诸如单个载体中，或者可包含在两个或更多个分开的核酸分子诸如两个或多个分开的载体中。“表达构建体”通常包括至少一个与目标核苷酸序列可操作连接的控制序列。以这种方式，例如，在用于在包括宿主细胞在内的生物体或其部分中表达的表达构建体中提供了与待表达的核苷酸序列可操作连接的启动子。对于本发明的实施，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的。参见例如，molecular cloning:a laboratory manual，第3版，第1、2和3卷，j.f.sambrook,d.w.russell和n.irwin,cold spring harbor laboratory press,2000。
[0088]
如本文中所用，“控制元件”、“控制序列”、“调控序列”等意指在特定宿主细胞中表
达可操作连接的编码序列所必需的核酸序列(例如dna)。例如，适用于原核细胞的控制序列包括启动子，以及任选地顺式作用序列，诸如操纵子序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括转录控制序列，诸如启动子、多聚腺苷酸化信号、转录增强子、翻译控制序列(诸如翻译增强子和内部核糖体结合位点(ires))、调节mrna稳定性的核酸序列，以及将由转录的多核苷酸编码的产物靶向细胞内的细胞内区室或细胞外环境的靶向序列。
[0089]
在一个实施方案中，编码本文所述的猫科动物epo构建体的核酸序列被工程改造成任何合适的遗传元件，其说明性实例包括裸dna、噬菌体、转座子、粘粒、rna分子(例如mrna)、附加体等，其将其上携带的epo序列转移至宿主细胞，例如用于在包装宿主细胞中产生携带dna或rna、病毒载体的纳米颗粒和/或用于递送至受试者的宿主细胞。在一个实施方案中，遗传元件是质粒。可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法递送所选择的遗传元件，所述方法的说明性实例包括通过转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包覆的微丸(high velocity dna-coated pellet)、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法也是核酸操作领域的技术人员所熟悉的，其说明性实例包括遗传工程、重组工程和合成技术。参见例如green和sambrook,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor press,cold spring harbor,ny(2012)，其全部内容通过引用并入本文。
[0090]
如本文中所用，“表达构建体”是指包含猫科动物epo的编码序列、启动子的核酸分子，并因此可包括其它调控序列，所述盒可被工程改造成遗传元件和/或包装到病毒载体(例如病毒颗粒)的衣壳中。通常，这种用于产生病毒载体的表达盒包含本文所述的猫epo构建体序列，其两侧为病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列，诸如本文所述的那些。如本文其它地方所述，可使用本领域已知的技术针对特定物种对任何表达控制序列进行优化(包括例如密码子优化)。
[0091]
表达盒通常包含启动子序列作为表达控制序列的一部分。启动子是启动特定基因或下游核酸转录的核酸区域。启动子可位于基因转录起始位点附近。启动子是表达盒和表达载体的关键元件，并且可以与其它调控元件诸如增强子、沉默子和绝缘子(insulator)结合起来起作用，以指导给定基因的转录水平。因此，不同的启动子可以指导不同水平的转录。
[0092]
如本文其它地方所述，本公开涉及用于重组猫科动物epo的受控表达的表达构建体用于在有此需要的猫科动物受试者中促进(或恢复)红细胞稳态的用途。应当理解，重组猫科动物epo的表达水平可通过用于驱动重组猫科动物epo在猫科动物受试者中表达的启动子类型来适当控制。
[0093]
应当理解，在启动子的上下文中，术语“强”和“弱”通常用于根据其对转录速率和随后的基因表达的影响来描述启动子，其中“强”启动子通常提供比“弱”启动子更快的转录速率。根据启动子对rna聚合酶(和/或σ因子)的亲和力，可以将启动子分为强启动子和弱启动子；这通常与启动子序列与聚合酶的理想共有序列的相似程度相关。启动子的强度也可依赖于转录起始是以高频率还是低频率在该启动子上发生。具有不同强度的不同启动子可用于构建具有不同基因/蛋白质表达水平的遗传回路(例如从弱启动子启动的表达水平低于从强启动子启动的表达水平)。
[0094]
如本文中所用，术语“强启动子”是指与弱启动子相比，允许在其控制下的基因以
更高水平表达的启动子。强启动子可以是天然存在的，或者其可以是经修饰的或合成的启动子，例如天然存在的启动子的衍生物。因此其可以是天然的或非天然的。术语“强启动子”为本领域技术人员所熟悉，其说明性实例在文献中有广泛描述(参见例如schlabeach等人，2010,pnas,107(6):2538-2543和bienick等人，2014,plos online,9(10):e109105，其内容通过引用以其整体并入本文)。强启动子可以从目标基因产生大量的转录物和最终蛋白质产物。例如，强启动子可以以总细胞蛋白质的至少1％的水平表达蛋白质。优选地，强启动子可以以总细胞蛋白质的2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的水平表达蛋白质。因此，如果启动子在特定宿主细胞和表达系统的情况下在选定的条件下达到上述表达水平，则其可以是强启动子，即，其可以是用于特定方法和所用试剂的强启动子。优选地，强启动子允许目标基因表达，使得由所述目标基因编码的蛋白质可以以至少1毫克/升的量从细胞中纯化。更优选，以每升5毫克的量从细胞中纯化所述目标基因编码的蛋白质。甚至更优选，以每升10毫克的量从细胞中纯化所述目标基因编码的蛋白质。强启动子通常驱动编码序列以高水平，或以约{分数(1/10)}的转录物至约{分数(1/100)}的转录物至约{分数(1/1000)}的转录物表达。
[0095]
通常，“弱启动子”是与强启动子相比以低水平驱动编码序列表达的启动子。“低水平”旨在指处于约{分数(1/10,000)}的转录物至约{分数(1/100,000)}的转录物的水平。在本公开的某些方面，驱动猫科动物epo表达的启动子是弱启动子。也就是说，与强启动子相比，其指导更低水平的猫科动物epo转录。启动子的相对弱性可以通过本领域已知的方法诸如通过qin等人(2010,plos one,5(5):e10611；1-4)(其全部内容通过引用并入本文)中公开的方法来测定。合适的弱启动子为本领域技术人员所熟悉，其说明性实例广泛地描述于schlabeach等人(2010,pnas,107(6):2538-2543)和bienick等人(2014,plos online,9(10):e109105)，其内容通过引用以其整体并入本文)。
[0096]
当在相同的载体环境中使用时(即，载体的所有其它元件都是相同的)，并且当在相同的细胞类型和相同的条件下表达时，可以评估启动子的强度，无论是“强”还是“弱”。在这种情况下，可使用启动子强度的任何合适的量度，例如转录物数或产生的蛋白质的量。
[0097]
合适的强启动子的说明性实例包括pm启动子、ptac、 rna聚合酶启动子(p7φl 0)、xpl和pbad以及任何前述启动子的衍生物。优选地，强启动子允许重组猫科动物epo在宿主细胞中表达，使得可以以至少1毫克/升、更优选5毫克/升或甚至更优选10毫克/升的量从细胞中纯化重组猫epo。强启动子通常会驱动编码序列以高水平，或以约{分数(1/10)}的转录物至约{分数(1/100)}的转录物至约{分数(1/1000)}的转录物表达。
[0098]
强启动子的其它说明性实例包括人巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、ef1a启动子、人β肌动蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、mpsv、λ噬菌体的pr启动子和pl启动子、包括rsv ltr、hiv-1 ltr、htlv-1 ltr在内的病毒ltr等。其它元件也可用于增强表达，诸如hiv tat和tar系统。其它强启动子包括诱导型启动子。
[0099]
弱启动子的说明性实例包括pcon(参见例如dobrynin等人，nucleic acid res.symp.ser.,7,365-376,1980)、ubc启动子和pgk启动子。
[0100]
在另一个实施方案中，启动子是tbg启动子。
[0101]
在一个实施方案中，启动子是cb7启动子。cb7是带有巨细胞病毒增强子元件的鸡
β-肌动蛋白启动子。或者，可使用其它肝特异性启动子(参见例如肝特异性基因启动子数据库，cold spring harbor,http://rulai.schl.edu/lspd，α1抗胰蛋白酶(a1at)；人白蛋白miyatake等人，j.virol.,71:512432(1997)、humalb和乙型肝炎病毒核心启动子，sandig等人，gene ther.,3:10029(1996))。ttr最小增强子/启动子、α-抗胰蛋白酶启动子、lsp(845nt)25(需要无内含子scaav)。在一个实施方案中，使用了肝脏特异性启动子甲状腺素结合球蛋白(tbg)。其它启动子，诸如病毒启动子、组成型启动子、调控型启动子(参见例如wo 2011/126808和wo 2013/04943)或响应生理信号(physiologic cues)的启动子可用于本文所述的载体中。
[0102]
除了启动子之外，表达盒和/或载体可包含其它合适的转录起始序列、终止序列、增强子序列、高效的rna加工信号(诸如剪接和多腺苷酸化(polya)信号)；tata序列；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即kozak共有序列)；内含子；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。表达盒或载体可以不含本文所述的任何元件、含有一种或多种本文所述的任何元件。合适的polya序列的实例包括例如sv40、牛生长激素(bgh)和tk polya。合适的增强子的实例包括例如cmv增强子、rsv增强子、α甲胎蛋白增强子、ttr最小启动子/增强子、lsp(th-结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/bikunin增强子)等。
[0103]
因此，猫科动物epo的表达水平和有效促进有此需要的猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量可取决于所采用的启动子的类型，这可决定有效促进或恢复猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量。因此，在本文公开的另一方面，提供了用于促进患有贫血的猫科动物受试者的红细胞稳态的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用包含重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述重组腺相关病毒包含aav衣壳，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导受试者中epo表达的表达控制序列，其中以有效促进猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量向受试者施用所述组合物，其中所述剂量使猫科动物受试者的pcv有效增加约5至约30个pcv％点，优选至少约15个pcv％点的值。
[0104]
在本文公开的另一方面，提供了用于促进患有贫血的猫科动物受试者的红细胞稳态的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用包含重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述重组腺相关病毒包含aav衣壳，其中所述aav衣壳包含编码猫科动物红细胞生成素(epo)的核酸序列和指导受试者中epo表达的表达控制序列，其中以有效促进猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量向受试者施用所述组合物，其中所述剂量在猫科动物受试者中有效地提供pcv的增加，其相当于通过约2
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更少的剂量的aav衣壳(其中猫科动物epo的表达由强启动子驱动)实现的pcv的增加。在一个实施方案中，所述剂量可在猫科动物受试者中有效地提供pcv的增加，其相当于通过约1
×
109个基因组拷贝/kg体重(gc/kg)或更少的剂量的aav衣壳(其中猫科动物epo的表达由强启动子驱动)实现的pcv的增加。
[0105]
在一个实施方案中，表达控制序列包含组织特异性启动子。合适的组织特异性启动子为本领域技术人员所熟悉。在一个实施方案中，组织特异性启动子是肾特异性启动子或肌肉特异性启动子。在一个实施方案中，组织特异性启动子选自nkcc2启动子、尿调节蛋白启动子、ksp-钙粘蛋白启动子和thp基因启动子。
[0106]
在一个实施方案中，aav衣壳还包含内含子、kozak序列、polya和转录后调控元件
中的一者或多者。
[0107]
合适的aav衣壳为本领域技术人员所熟悉，其说明性实例包括aav1、aav5、aav6、aav8、aavrh64r1、aav9、aavrh91、aavhu.37、aav3b、aav3b.ar2.12和aavrh10。在一个实施方案中，aav衣壳选自aav1、aav5、aav6、aav8、aavrh64r1、aav9、aavrh91、aavhu.37、aav3b、aav3b.ar2.12和aavrh10。
[0108]
在一个实施方案中，aav衣壳是aav8衣壳。在一个实施方案中，aav衣壳是aav1衣壳。
[0109]
除了启动子之外，表达盒和/或载体还可包含其它合适的转录起始序列、终止序列、增强子序列、有效的rna加工信号(诸如剪接和多腺苷酸化(polya)信号)；tata序列；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即,kozak共有序列)；内含子；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。表达盒或载体可以不含本文所述的任何元件、含有一种或多种本文所述的任何元件。合适的polya序列的说明性实例包括sv40、牛生长激素(bgh)和tk polya。合适的增强子的实例包括例如cmv增强子、rsv增强子、α甲胎蛋白增强子、ttr最小启动子/增强子、lsp(th-结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/bikunin增强子)等。
[0110]
在一个实施方案中，病毒载体包括核酸表达盒，其包含：5’aav反向末端重复序列(itr)、具有任选增强子的启动子、epo序列、poly a序列和3’aav itr，其中所述表达盒在宿主细胞中表达功能性猫科动物epo。
[0111]
这些控制序列与epo构建体序列“可操作地连接”。如本文中所用，术语“可操作地连接的”既指与目标基因相邻的表达控制序列，也指反式或远距离作用以控制目标基因的表达控制序列。
[0112]
可将表达盒工程改造到用于生产病毒载体的质粒上。将表达盒包装到aav病毒颗粒中所需的最小序列是aav 5’和3’itr，它们可能与衣壳具有相同的aav来源，或不同的aav来源(以产生aav假型)。在一个实施方案中，出于方便使用来自aav2的itr序列或其缺失形式(δitr)，并将其用于加速监管批准。然而，也可以选择其它aav来源的itr。当itr的来源来自aav2而aav衣壳来自另一种aav来源时，所得的载体可被称为假型化的。通常，aav载体的表达盒包含aav 5’itr、前肽-epo活性肽编码序列和任何调控序列，以及aav 3’itr。然而，这些元件的其它配置可以是合适的。已经描述了其中缺失了d-序列和末端解析位点(terminal resolution site)(trs)的5’itr的缩短形式(称为δitr)。在其它实施方案中，使用全长aav 5’和3’itr。
[0113]
缩写“sc”是指自身互补的。“自身互补aav”是指具有其中重组aav核酸序列携带的编码区被设计成形成分子内双链dna模板的表达盒的质粒或载体。感染后，不是等待细胞介导的第二条链的合成，而是scaav的两个互补的一半将缔合形成一个双链dna(dsdna)单位，其能够立即复制和转录。参见例如d m mccarty等人，“self-complementary recombinant adeno-associated virus(scaav)vectors promote efficient transduction independently of dna synthesis”,gene therapy,(2001年8月)，第8卷，第16期，第1248-1254页。自身互补的aav描述于例如美国专利第6,596,535号、第7,125,717号和第7,456,683号(其每一篇均通过引用以其整体并入本文)中。
[0114]
腺相关病毒(aav)病毒载体是具有其中包装有用于递送至靶细胞的核酸序列的
aav蛋白衣壳的aav dna酶抗性颗粒。aav衣壳由60个衣壳(cap)蛋白亚单位vp1、vp2和vp3组成，取决于所选的aav，所述vp1、vp2和vp3以大约1:1:10至1:1:20的比例以二十面体对称排列。可选择aav血清型作为aav病毒载体的衣壳(dna酶抗性病毒颗粒)的来源，所述aav病毒载体包括例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、rh10、aavrh64r1、aavrh64r2、rh8、rh.10、任何已知或提及的aav的变体或尚未被发现的aav。在一个实施方案中，aav是aav8衣壳或其变体。在另一个实施方案中，aav是aav1衣壳或其变体。参见例如美国公布的专利申请第2007-0036760-a1号；美国公布的专利申请第2009-0197338-a1号；ep 1310571。也参见wo 2003/042397(aav7和其它猿猴aav)、美国专利7790449和美国专利7282199(aav8)、wo 2005/033321和us 7,906,111(aav9)、wo 2006/110689和wo 2003/042397(rh.10)。或者，基于任何所述aav的重组aav可用作aav衣壳的来源。这些文献还描述了可被选择用于产生aav的其它aav，并且通过引用并入本文。在一些实施方案中，用于病毒载体的aav帽可通过诱变(即，通过插入、缺失或取代)前述aav帽之一或其编码核酸来产生。在一些实施方案中，aav衣壳是嵌合的，包含来自两种或三种或四种或更多种上述aav衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，aav衣壳是来自两种或三种不同aav或重组aav的vp1、vp2和vp3单体的嵌合体。在一些实施方案中，raav组合物包含不止一种上述帽。在另一个实施方案中，aav衣壳包括可包括与任何描述的或已知的aav衣壳序列相比高达约10％变异的变体。也就是说，aav衣壳与本文提供的和/或本领域已知的aav衣壳具有约90％至约99.9％的同一性、约95％至约99％的同一性或约97％至约98％的同一性。在一个实施方案中，aav衣壳与aav1衣壳有至少95％的同一性。在一个实施方案中，aav衣壳与aav8衣壳有至少95％的同一性。当确定aav衣壳的同一性百分比时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行比较。在一个实施方案中，aav衣壳与aav8 vp3共享至少95％的同一性。在另一个实施方案中，aav衣壳与aav1 vp3共享至少95％的同一性。在另一个实施方案中，使用自身互补的aav。
[0115]
为了将表达盒包装到病毒体中，在与基因相同的构建体中，itr是顺式所需的唯一aav组件。在一个实施方案中，从aav基因组中去除用于复制(rep)和/或衣壳(cap)的编码序列，并反式地或通过包装细胞系提供其，以产生aav载体。例如，如上所述，假型化的aav可含有来自不同于aav衣壳来源的来源的itr。另外或可选地，可利用嵌合的aav衣壳。还可选择其它aav组件。此类aav序列的来源描述于本文中，也可以从学术、商业或公共来源(例如美国典型培养物保藏中心，manassas，va)分离或获得。或者，通过参考公布的序列，诸如可在文献或数据库(例如等)中获得的序列，可通过合成或其它合适的方法获得aav序列。
[0116]
用于产生和分离适于递送至受试者的aav病毒载体的方法是本领域已知的(参见例如美国专利7790449；美国专利7282199；wo 2003/042397；wo 2005/033321、wo 2006/110689；us 7588772 b2和wo 2017/040524，其内容通过引用以其整体并入本文)。在一个实施方案中，用编码转基因的构建体和编码rep和cap的一种或多种构建体瞬时转染生产细胞系，所述转基因的两侧为反向末端重复序列(itr)。在另一个实施方案中，用编码两侧为itr的转基因的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在这些系统中的每一个中，aav病毒体是响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染而产生的，需要将raav与污染病毒分离。最近，已经开发了不需要感染辅助病毒来恢复aav的系统-所需的辅助功能(即，腺病毒e1、
e2a、va和e4或疱疹病毒ul5、ul8、ul52和ul29以及疱疹病毒聚合酶)也由该系统反式提供。在这些较新的系统中，可通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可将细胞工程改造成稳定包含编码辅助功能的基因，所述基因的表达可在转录或转录后水平上受到控制。在另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染，将两侧为itr的转基因和rep/cap基因引入昆虫细胞。关于这些生产系统的综述，一般参见例如zhang等人(2009,human gene therapy20:922-929，其全部内容通过引用并入本文)。制造和使用这些和其它aav生产系统的方法也描述于以下美国专利(其全部内容通过引用并入本文)中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823和7,439,065。通常参见例如grieger及samulski,2005,adv.biochem.engin/biotechnol.99:119-145；buning等人，2008,j.gene med.10:717-733)。构建本文所述任何实施方案的合适方法将为核酸操作领域的技术人员所熟悉的，其说明性实例包括遗传工程、重组工程和合成技术(参见例如green和sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor press,cold spring harbor,ny(2012))。同样地，产生raav病毒体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如k.fisher等人，(1993)j.virol.,70:520-532和美国专利第5,478,745号)。
[0117]
本文还提供了包含本文所述病毒载体构建体的组合物。本文所述的药物组合物被设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至有此需要的受试者。直接递送至肝脏(任选地通过静脉内、通过肝动脉或通过移植)、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它肠胃外施用途径。可在单一组合物或多种组合物中递送本文所述的病毒载体。任选地，可以递送两种或多种不同的aav，或多种病毒(参见例如wo 2011/126808和wo2013/049493)。在另一个实施方案中，多种病毒可以包含不同的复制缺陷型病毒(例如aav和腺病毒)。
[0118]
可将复制缺陷型病毒与生理学上可接受的运载体一起配制，用于基因转移和基因疗法应用。在aav病毒载体的情况下，基因组拷贝(“gc”)的定量可用作制剂或悬浮液中所含剂量的量度。本领域已知的任何方法都可用于确定本发明的复制缺陷型病毒组合物的基因组拷贝(gc)数。进行aav gc数量滴定的一种方法如下：首先用dna酶处理纯化的aav载体样品，以从生产过程中除去无外壳的aav基因组dna或污染性质粒dna。然后对dna酶抗性颗粒进行热处理，以从衣壳中释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区域(通常为poly a信号)的引物/探针组，通过实时pcr对释放的基因组进行定量。
[0119]
剂量和剂型
[0120]
如本文其它地方所述，本发明至少部分基于本发明人的惊人发现：即(i)适于驱动重组猫科动物epo的表达并且原本足以增加健康猫科动物受试者的血细胞比容或红细胞压积的腺病毒载体剂量对患有贫血的猫科动物受试者出乎意料地有害或致命；(ii)当以预期不会增加健康猫科动物受试者的血细胞比容或红细胞压积的较低剂量向贫血猫科动物受试者施用表达猫科动物epo的腺病毒载体时，仍然可在贫血的猫科动物受试者中恢复红细胞稳态，以及(iii)本文所述的低剂量治疗方案将贫血动物中红细胞增多症的风险降至最低。
[0121]
有效促进或以其它方式恢复猫科动物受试者(尤其是贫血的猫科动物受试者)的红细胞稳态的剂量优选为约2
×
109gc/kg或更低。在一个实施方案中，有效促进或以其它方
式恢复猫科动物受试者(特别是贫血的猫科动物受试者)的红细胞稳态的剂量优选为约1
×
109gc/kg或更低。应当理解，剂量范围的下限可以是除零外的小于约2
×
109gc/kg的任何数值，其有效促进或以其它方式恢复猫科动物受试者的红细胞稳态，优选促进或以其它方式恢复猫科动物受试者的红细胞稳态到治疗开始后约70天。在一个实施方案中，所述剂量为约1
×
108至2
×
109gc/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约1
×
108至1
×
109gc/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约2
×
108至1
×
109gc/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约2
×
108至6
×
108gc/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约5.5
×
108至约1.4
×
109gc/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约2
×
108至1.8
×
109gc/kg。
[0122]
在一个实施方案中，所述剂量是(i)对于体重2至6kg的猫科动物受试者为约3.65
×
109个基因组拷贝，或(ii)对于体重超过6kg的猫科动物受试者为约7.30
×
109个基因组拷贝。在一个实施方案中，对于体重超过6kg的猫科动物受试者，剂量为约7.30
×
109个基因组拷贝。
[0123]
如本文其它地方所述，当猫科动物epo的表达由弱启动子驱动时，可相应地调整剂量，以实现与强启动子相比相同或基本相同的表达水平。在使用弱启动子的一个实施方案中，有效促进或以其它方式恢复猫科动物受试者的红细胞稳态的剂量是足以在猫科动物受试者中实现与使用强启动子时通过约3
×
109gc/kg或更低的剂量所实现的表达水平相当的猫科动物epo表达水平的剂量。本领域技术人员可以确定在使用强启动子时，足以在猫科动物受试者中实现与通过约2
×
109gc/kg或更低的剂量，或者通过约1
×
109gc/kg或更低的剂量所实现的表达水平相当的猫科动物epo表达水平的剂量。此类剂量可通过施用大于约1
×
109gc/kg的量来实现。可选地，或另外地，此类剂量可通过连续给药来实现；也就是说，超过一个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)的连续剂量。
[0124]
在一些实施方案中，可以以分次剂量递送病毒基因组的量。在一个实施方案中，对于兽医受试者，所述构建体可以以1μl至约100ml的体积递送(关于对各种兽医动物施用物质的良好实践的论述参见例如diehl等人，2001,j.applied toxicology,21:15-23，其内容通过引用以其整体并入本文)。因此，如本文中所用，术语“剂量(dosage)”或“剂(dose)”可指在治疗过程中递送至受试者的总剂量，或在单次(或多次)施用中递送的量。在一个实施方案中，向猫科动物受试者施用的剂量为约1.0
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝。在一个实施方案中，向猫科动物受试者施用的剂量为约1.2
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝。在一个实施方案中，向猫科动物受试者施用的剂量为(i)在体重为2至6kg的猫科动物受试者中是约3.65
×
109个基因组拷贝，或(ii)在体重超过6kg的猫科动物受试者中是约7.30
×
109个基因组拷贝。在一个实施方案中，向体重超过6kg的猫科动物受试者施用两个剂量，每个剂量包含约3.65
×
109个基因组拷贝。
[0125]
用于将重组载体递送至宿主细胞的合适方法是本领域技术人员已知的。可向猫科动物受试者施用raav，其优选悬浮在生理相容的运载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂中。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的运载体。例如，合适的运载体包括盐水，其可用多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。合适载体的其它说明性实例包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。
[0126]
任选地，除了raav和/或变体和运载体之外，本文所述的组合物还可包含其它常规药物成分，诸如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括三氯丁醇、山梨酸钾、山梨
酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
[0127]
本文所述的病毒载体和其它构建体可用于制备药物，所述药物用于将epo构建体递送至有此需要的猫科动物受试者和/或用于治疗猫科动物受试者的慢性肾病。因此，另一方面，提供了治疗猫科动物受试者的慢性肾病的方法。因此，在一个实施方案中，猫科动物受试者患有慢性肾病。在另一个实施方案中，向猫科动物受试者静脉内施用组合物。
[0128]
在一个实施方案中，该方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括含有本文所述的epo表达盒的病毒载体。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述受试者是猫科动物。另一方面，提供了治疗贫血的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物。在一个实施方案中，该组合物包括含有本文所述的epo表达盒的病毒载体。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述受试者是猫科动物。
[0129]
在一个实施方案中，提供了用于治疗猫科动物的慢性肾病的方法。该方法包括施用包含含有编码猫科动物epo的序列的核酸分子的aav病毒载体。
[0130]
在本文公开的另一方面，提供了治疗患有慢性肾病的贫血的猫科动物受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含如本文所述的重组腺相关病毒(raav)的组合物，其中以约2
×
109个基因组拷贝/kg体重或更低的剂量向受试者施用该组合物。在本文公开的另一方面，提供了如本文所述的重组腺相关病毒(raav)的用途，其中将组合物配制成以约2
×
109个基因组拷贝/kg体重或更低的剂量施用。在本文公开的另一方面，提供了用于治疗患有慢性肾病的贫血的猫科动物受试者的药物组合物，其中该组合物包含如本文所述的重组腺相关病毒(raav)，其中将该组合物配制成以约2
×
109个基因组拷贝/kg体重或更低的剂量施用。
[0131]
疗程可任选地包括重复施用相同的病毒载体(例如aav8载体或aav1载体)或不同的病毒载体(例如aav8和aavrh10；aav1和aav8；aav1和aavrh10；等等)。也可以使用合适的病毒载体(包括本文所述的那些)选择其它组合。还可将本文所述的组合物适当地组合在方案中，所述方案包括例如其它药物或基于蛋白质的疗法，包括例如重组猫科动物epo蛋白，和/或生活方式的改变，诸如饮食和锻炼方案。
[0132]
本文使用的术语“调节”或其变型是指组合物抑制生物途径的一种或多种组分的能力。
[0133]
在本文公开的另一方面，提供了包含本文所述重组腺相关病毒(raav)的单位剂型，其中该剂型以约1.0
×
109至约5.0
×
109个基因组拷贝的量包含raav。在一个实施方案中，单位剂型以约1.2
×
109至约5.0
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109个基因组拷贝的量包含raav。在一个实施方案中，单位剂型以约1.2
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109个基因组拷贝的量包含raav。在一个实施方案中，单位剂型以约2.4
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109个基因组拷贝的量包含raav。在一个实施方案中，单位剂型以约3.65
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109个基因组拷贝的量包含raav。在一个实施方案中，单位剂型以约4.86
×
109个基因组拷贝的量包含raav。在一个实施方案中，所述剂型是肌内剂型。
[0134]
本公开还扩展至包含本文所述组合物或剂型的药盒。该药盒还可包含说明书，包括根据本文所述的方法和用途使用该组合物或剂型的说明书。该药盒还可包含呈冻干形式的本文所述的组合物或剂型。制备冻干形式的合适方法为本领域技术人员所熟悉。当药盒
包含冻干形式的组合物或剂型时，药盒还可包括含有药学上可接受的稀释剂的单独容器，用于在施用(包括根据本文所述的方法和用途进行肌内施用)前复原冻干形式。
[0135]
除非本说明书中另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的和通过参考出版的教科书通常理解的含义相同的含义，所述教科书为本领域技术人员提供了对本技术中所用的许多术语的一般性指导。
[0136]
以下实施例仅用于说明，并不旨在限制本发明。
[0137]
实施例
[0138]
实施例1-aav-猫科动物epo表达载体的构建
[0139]
通过对genbank登录号为afn85670.1的编码猫科动物epo(seq id no:1)的核酸序列进行密码子优化产生编码猫科动物epo前蛋白的核酸序列。将经密码子优化的核酸序列(seq id no:2)克隆到含有鸡β-肌动蛋白启动子和部分cmv立即早期增强子的表达载体中。表达构建体的两侧是两个(5’和3’)aav2反向末端重复序列(itr)。在用辅助质粒和反式质粒进行三重转染后，将猫科动物构建体包装在aav血清型1(aav1)衣壳中。然后通过碘克沙醇梯度纯化对其进行纯化，并通过taqman定量pcr进行滴定。aav1-猫科动物epo表达载体如图5所示，在本文中也称为sb-001。
[0140]
实施例2-正常猫中aav介导的猫科动物红细胞生成素的表达
[0141]
为了评价施用aav1-猫科动物epo表达载体sb-001的安全性和血液病学反应，以不同剂量向健康成年猫施用单次肌内(im)剂量。
[0142]
本研究是作为具有随机、有对照、平行设计的单点非临床实验室研究进行的。使三十四(34)只猫适应研究条件7天，融合选择30只猫进入给药阶段。在接受单次im剂量的sb-001或磷酸盐缓冲盐水安慰剂之前，将猫随机分配到五个性别平衡的组。如图1所示，将剂量组在第0天处理一次。在给药前后的不同时间点对注射部位评估、身体检查和体重进行评估。在给药前后的时间点收集血液用于临床化学和潜在免疫原性评估。每天进行临床观察以评估整体健康状况。给药前使用自动分析仪进行三次全面血液病学评估，然后在整个研究期间每周进行一次。另外，根据需要，每周进行一次手动pcv/tp测量，以监测hct水平过高的猫。在给药后第56天和第60天，为所有猫生成手动pcv/tp数据。在研究结束时，对所有服用sb-001的猫实施安乐死并进行尸检。
[0143]
单次im注射后，sb-001在所评估的两个最高剂量水平(t3：1.9
×
109个基因拷贝/千克体重(gc/kg)和t4：6.0
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109gc/kg)下产生hct的持续且统计上显著的变化。最低剂量(t1；1.9
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108gc/kg和t2；6.0
×
108gc/kg)在整个研究过程中都未产生hct的任何一致的变化。t2组、t3组和t4组中观察到的红细胞图变化在很大程度上是意料之中的，这些发现都不被视为额外的具有临床意义的安全性信号。
[0144]
在健康猫中以1.9x109(t3)和6.0x109gc/kg(t4)的剂量通过肌内注射给予单剂量的sb-001产生了hct的持续且统计上显著的变化。这种红细胞血液病学反应持续了62/63天的时期，在任何剂量水平下均未发现有临床意义的安全性问题(图1)。这些数据在很大程度上与由walker等人(2005,ajvr,66(3):450-456)和beall等人(2000,gene therapy,7:534-539)报道的先前研究一致。例如，beall等人表明，只有1.25
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10
12
gc/kg剂量的腺病毒-猫科动物epo表达载体才能有效增加健康猫受试者的hct。1.25
×
10
10
gc/kg的最低剂量被证明是无效的。同样地，walker等人表明：在所测试的剂量(约1.5
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107gc/kg、1.5
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108gc/kg和1.5
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109gc/kg)中，只有最高剂量(1.5x109gc/kg)显示健康猫的hct增加，而在任何较低的测试剂量下都没有影响。
[0145]
根据来自健康猫的上述数据，本发明人采用3.0
×
109gc/kg的平均剂量来研究sb-001构建体在患有慢性肾病的贫血猫中的效果。这在下面的实施例3中列出。
[0146]
实施例3
–
患有慢性肾病的猫中aav介导的猫科动物红细胞生成素表达的剂量研究
[0147]
在本研究中，三只猫(clara、cosmo和oliver)(各自经诊断患有与慢性肾病(ckd)相关的贫血)接受sb-001(im；3.0
×
109gc/kg)。令人惊讶的是，原本发现在健康猫中有效增加hct的3.0
×
109gc/kg剂量的sb-001在贫血的猫中不能被很好地耐受或者是致命的。这些结果示于图2中，并在下面进一步描述：
[0148]
·
oliver:18.5岁，mc maine coon
[0149]
·
第70天由sb-001epo导致红细胞增多症(pcv 29.1％至55.7％＝26.6个点的增加)
[0150]
·
第89天-死于急性坏死性胰腺炎
[0151]
·
clara:19.3岁，fs,dsh
[0152]
·
在第28天由sb-001epo导致的红细胞增多症(pcv 15.3％至54.5％＝39.2个点的增加)
[0153]
·
在d27发作，2次静脉切开术
[0154]
·
由于ckd进展而在d55实施安乐死
[0155]
·
cosmo:17岁，mc,dsh
[0156]
·
iris iv:登记时肌酐/bun：
[0157]
·
pcv增加过快，如果能够继续研究，可能会出现红细胞增多症(pcv 12％至40.9％＝29个点的增加)
[0158]
·
在第46天安乐死-ckd的进展
[0159]
实施例4
–
在患有慢性肾病的猫中优化aav介导的猫科动物红细胞生成素的表达
[0160]
该研究试图调查较低剂量的sb-001在贫血的猫中是否可以有效，尽管早期发现较低剂量对促进健康猫的红细胞稳态无效(如上文实施例2所述，并且与beall等人和walker等人的发现一致)。该研究设计类似于上述实施例3的研究，不同之处在于其不是盲法的并且没有使用安慰剂。动物服用的sb-001剂量约为2.0
×
108至6.0
×
108gc/kg。
[0161]
在招募第一批7只猫后，进行了修改，以使对治疗无反应的猫在第42天接受3倍加强剂量。八只加强剂量的猫中有七只符合成功标准(pcv增加到正常范围或增加至少5个pcv百分点)。如果不进行治疗，预期猫的pcv随着时间的推移而下降。
[0162]
通过在治疗后稳定或增加pcv(使用微量血球容量计(microhaematocrit)从离心的全血中测量的)来显示功效。
[0163]
令人惊讶的是，在研究队列中观察到22.5％至33.6％的pcv的平均增加(图3)，并且没有猫需要治疗红细胞增多症。这些结果是令人惊讶和意外的，注意到类似剂量的sb-001在增加健康猫的hct或pcv方面是无效的。
[0164]
实施例5
–
患有慢性肾病的猫中aav介导的猫科动物红细胞生成素表达的剂量优化
[0165]
本研究试图证实较低有效剂量的sb-001对贫血的猫有效。
[0166]
本研究设计类似于上述实施例4的研究。简言之，在研究开始时，对动物施用单剂
量的约3.65x109个基因拷贝(gc)的sb-001。这一剂量相当于约5.5
×
108至1.4
×
109gc/kg体重(bw)，如下表1所示。
[0167]
表1：施用于猫的sb-001的剂量
[0168][0169][0170]
八只接受治疗的猫中有七只符合成功标准，即pcv增加到正常范围内或增加至少5个pcv百分点。如果不进行治疗，pcv值预计会随着时间的推移而降低。
[0171]
通过在治疗后稳定或增加pcv(使用微量血球容量计从离心的全血中测量的)来显示功效。
[0172]
令人惊讶的是，在研究队列中观察到pcv从21.25％至39.75％的的平均增加，如下表2所示，并且没有猫需要针对红细胞增多症的后续治疗。这些结果令人惊讶和意外的，因为注意到类似剂量的sb-001在增加健康猫的hct或pcv方面无效。
[0173]
表2：用sb-001治疗的患有慢性肾病的猫中pcv值的变化
[0174][0175][0176]
实施例6-患有终末期慢性肾病的贫血猫在用sb-001治疗后的存活
[0177]
该研究旨在确定较低有效剂量的sb-001对患有终末期(4期)慢性肾病的贫血猫的存活的影响。该研究类似于上述实施例4和5中阐述的研究。简言之，如以上实施例4中所述，以约2
×
108至1.8
×
109gc/kg体重的总剂量给患有终末期(4期)慢性肾病的贫血猫施用sb-001，包括在需要时施用第二剂量。
[0178]
令人惊讶的是，用低剂量sb-001治疗的9只猫中有4只存活超过99天。这与boyd等人2008；j vet intern med2008；22:1111
–
1117)的发现形成对比，后者显示猫从诊断出4期慢性肾病到死亡的存活中位数为35天(参见boyd等人2008的表2)。用sb-001治疗的4期猫增加的中位存活时间(天数)为64天(参见图6和表3)。
[0179]
表3：用sb-001治疗的贫血猫的存活-从诊断出4期慢性肾病到死亡
[0180][0181][0182]
当整理来自实施例3-6的猫科动物受试者的存活数据时，令人惊讶地发现，与接受替代干预的猫科动物受试者相比，用低剂量sb-001治疗的猫从治疗时间起存活了超过三倍长的时间，如boyd等人(2008)所述。这些发现示于下表4。
[0183]
表4：患有终末期(第4阶段)慢性肾病的贫血猫的存活期中值-从诊断到死亡
[0184][0185]
*从第0天(第一治疗日)开始的存活期；来自参与上述实施例3-6所述研究的所有sb-001治疗猫的数据(n＝23)。
[0186]
**如boyd等人(2008)的表3所述
[0187]
实施例7-用aav8介导的猫科动物红细胞生成素表达治疗患有慢性肾病的贫血猫
[0188]
编码猫科动物epo前蛋白的核酸序列将获自genbank(例如登录号afn85670)。将该序列克隆到含有鸡β-肌动蛋白启动子和部分cmv立即早期增强子的表达载体中。表达构建体的两侧为两个(5’和3’)aav2反向末端重复序列(itr)。通过三重转染和碘克沙醇梯度纯化，将猫科动物构建体包装在aav血清型8(aav8)衣壳中，并通过taqman定量pcr进行滴定，以产生aav 8-猫科动物epo表达载体。
[0189]
将向贫血的猫施用约2.0
×
109gc/kg或更低的肌内(im)剂量的aav8-猫科动物epo表达载体，并且将如本文其它地方所述测定hct和/或pcv的变化。通过pcv稳定或增加进入
正常范围或者至少5个pcv百分点的增加(例如如使用微量血球容量计从离心的全血测量的)来显示功效。