5α-羟基-6β-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-醇的前药及包含其的用于癌症治疗的药物组合物的制作方法

5
α-羟基-6
β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3
β-醇的前药及包含其的用于癌症治疗的药物组合物
技术领域
[0001]
本发明涉及甾醇化合物领域，特别地涉及化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇的前药以及特别地用于癌症治疗的包含该前药的药物组合物。


背景技术：

[0002]
术语“癌症”或“癌性肿瘤”包括特征在于异常细胞不受控制地增殖和扩散的一组疾病。如果癌细胞没有被清除，疾病会或多或少地迅速发展，从而导致患者死亡。
[0003]
癌症的治疗包括手术、放射治疗和化疗，所述手术、放射治疗和化疗可以单独使用，或同时使用或依次组合使用。化疗使用抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂是预防或抑制肿瘤成熟和增殖的药物。抗肿瘤剂通过有效靶向快速分裂的细胞而发挥作用。由于抗肿瘤剂会影响细胞分裂，具有高生长速率的肿瘤(例如急性髓细胞性白血病和侵袭性淋巴瘤，包括霍奇金病)对化疗更敏感，因为在任何给定的时间都有更高比例的被靶向细胞进行细胞分裂。具有较慢生长速率的恶性肿瘤，例如惰性淋巴瘤，对化疗的反应往往要不显著得多。然而，在化疗治疗期间，化学抗性的发展是一个持续存在的问题。例如，急性髓细胞性白血病(aml)的常规治疗包括阿糖胞苷与蒽环类药物(例如道诺霉素)的联合施用。年轻患者的5年总存活率为40％，老年患者为约10％。随着年龄的增长，响应率差异相当大，超过60岁的患者的响应率为40％至55％，而超过70岁的患者的响应率为24％至33％。对于具有不良细胞生成性特征的老年人来说，情况更糟，并且随着年龄的增长和恶化，治疗后30天内的死亡率从10％到50％不等。此外，这些分子的使用限制也是由于副作用，特别地由于出现慢性心脏毒性(与蒽环类药物有关)。在超过60岁的患者中，与加强化疗相关的毒性死亡率为10％至20％。
[0004]
在常规方案的这种获益-风险特征情况下，只有30％的新近诊断为aml的老年人接受了抗肿瘤化疗。
[0005]
在最近的几十年里，患有aml的年轻患者的治疗结果仅有略微的改善，但超过60岁的成年人(患有aml的大多数患者)的治疗结果没有改善。
[0006]
因此，确实需要开发可用于治疗这些癌性肿瘤的分子，这些肿瘤存在化学抗性和抗肿瘤药物的内在毒性问题。以上数据强调需要找到新的方法，该新的方法将减少用于治疗化学敏感性肿瘤的抗肿瘤剂的剂量与避免在对抗肿瘤药物具有抗性的肿瘤的化学抗性两方面结合起来。
[0007]
从ep3272350b1知晓了化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-醇(以树状配基(dendrogenin)a的命名知晓，用于治疗耐药性肿瘤)。树状配基(在下文中称为dx101)能够恢复耐药性肿瘤对抗肿瘤剂的敏感性，或增强抗肿瘤剂对肿瘤的作用，这进而使得其可以降低抗肿瘤剂对化学敏感性肿瘤的有效细胞毒性剂量。
[0008]
medina等人的文献(j.med.chem.,2009,52(23),7765-77,xp009131948)描述了在dx101的位置3包含乙酸根或丁酸根的化合物，其在体外的活性是不同的。
[0009]
本发明的一个目的是提供化合物树状配基a的新型化合物和类似物，其特别地用于治疗癌性肿瘤，化学敏感性肿瘤和/或耐药性肿瘤。
[0010]
令人惊讶的是，本发明人发现化合物树状配基a的特异性c3前药显示出与树状配基a的药理活性相当或更大的药理活性，特别地是具有良好的生物利用度以及在患者体内的持久的治疗效果。


技术实现要素：

[0011]
本发明首先涉及一种用作用于引起哺乳动物癌性肿瘤消退的药物的用途的式(i)化合物：或此类化合物的药学上可接受的盐，其中r1选自：-基团-c(o)nr2r3，其中r2、r3相同或不同，并且选自h和任选地含有一个或多个选自烯丙基、羰基和芳族杂环基团的取代基的直链或支链、饱和或不饱和c1-c8碳链，-基团-c(o)r4，其中r4选自-ch2ch3和-c5h
11
，-基团-c(o)or5，其中r5是直链或支链、饱和或不饱和的c1-c8碳链，-基团-c(o)chnh(coch2ch3)r6，其中r6是选自-ch
2-c3n2h2、ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-ch(ch3)2、-ch2c6h5、-ch2c8nh6、-(ch2)4nh2、-ch2c6oh5、-c3h5n的氨基酸的侧链。
[0012]
其次，本发明涉及一种用作用于引起哺乳动物癌性肿瘤消退的用途的药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含至少一种式(i)化合物。定义
[0013]
在本说明书中，除非另有规定，否则应理解，当给出范围时，该范围包括所述范围的上限和下限。
[0014]
在本文本中，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
[0015]
术语“溶剂化物”在这里用于描述包含本发明化合物并含有化学计量或亚化学计量的量的一种或多种药学上可接受的溶剂(例如乙醇)分子的分子复合物。术语“水合物”是指所述溶剂为水的情况。
[0016]
术语“烯丙基”是指简式h2c＝ch-ch
2-的官能性烯烃基团。
[0017]
术语“羰基”是指碳原子和氧原子之间的双键。
[0018]
术语“芳族杂环”是指单环和多环芳族化合物，其包含一个或多个来自o、s和/或n的杂原子作为环元素。在芳族杂环之中，我们可以提及咪唑、呋喃、噻吩、吡咯、嘌呤、嘧啶、吲哚和苯并呋喃。
[0019]
术语“人”是指任何性别和处于任何发育阶段的对象(即新生儿、婴儿、儿童、青少年、成人)。
[0020]
术语“患者”是指等待接受或正在接受医疗护理和/或将成为医疗干预对象的的热血动物(更优选地，人)。
[0021]“药学上可接受的”意指药学上可接受的产品的成分是相互兼容的，并且对接受该产品的患者是无害的。
[0022]
如本文使用的术语“药学载体”意指用作溶剂或稀释剂的惰性介质，在其中配制和/或施用药学活性剂。药学载体的非限制性示例包括乳膏、凝胶、乳液、溶液和脂质体。
[0023]
术语“施用”意指将药学上可接受的组合物中的活性剂或活性成分(例如式(i)化合物)递送给患有必须治疗的病况、症状和/或疾病的患者。
[0024]
本文中使用的术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括减轻、缓解、停止或治疗病况、症状和/或疾病。
[0025]
本说明书中使用的术语“前药”或“前药产品”表示式(i)化合物的药理学上可接受的衍生物，其可以被施用给患者而没有过度毒性、刺激、过敏反应等，其可通过代谢手段(例如通过水解)在体内转换，并且其在体内的生物转化产物产生生物活性药用产品。本说明书中描述的大多数前药的特征在于，生物利用度增加，并且易于代谢为在体内具有生物活性的化合物。前药以非活性或比其代谢产物活性低得多的形式施用。在本说明书中，前药具有与化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇相同、相似或更大的药理学性质。本发明中所述的某些前药，当其具有不高于参考化合物的生物利用度的生物利用度时，显示出更快的渗透性，并可更快地用于治疗癌症。
[0026]
本说明书中的术语“药用产品”或“药物”表示对人或动物疾病具有治疗或预防特性的任何化合物或组合物。延伸而言，药用产品包括可用于人类或动物或可被施用于他们的任何化合物或任何组合物，目的在于建立医学诊断或通过发挥药理学、免疫学或代谢作用来恢复、纠正或改变其生理功能。该药用产品由两种类型的物质组成，一种活性成分和一种或多种赋形剂。
[0027]
术语“活性成分”表示具有药理学作用和治疗作用的化合物。
[0028]
术语“赋形剂”是指药用产品中除活性成分之外的任何物质。
[0029]“耐药性癌症”是如下患者的癌症：其中癌症细胞的增殖不能通过抗肿瘤剂或通常用于治疗这种癌症的抗肿瘤剂的组合以患者可接受的剂量来阻止或抑制。肿瘤在化疗前可能具有内在耐药性，或者在最初对化疗敏感的肿瘤治疗过程中可能产生耐药性。
[0030]“化学敏感性癌症”是指对抗肿瘤剂的作用产生反应的患者癌症，也就是说，可以通过所述抗肿瘤剂以患者可接受的剂量阻止癌症细胞的增殖。
[0031]
式(i)化合物属于类固醇类。因此，式(i)化合物的碳原子的编号遵循iupac在pure&appl.chem.,第61卷,第10期,第1783-1822,1989页中定义的命名法。根据iupac，属于
类固醇类的化合物的碳原子的编号如下所示：
[0032]
在本说明书中，以下缩写意指：aml：急性髓细胞性白血病；树状配基a：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-醇；mcf-7：密歇根癌症基金会-7；dmem：dulbecco改良eagle培养基；fcs：胎牛血清；cheh：胆固醇环氧化物水解酶；neuro2a：鼠胶质母细胞瘤；ctl：对照；mtt：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物；pbs：磷酸盐缓冲盐水；dmso：二甲基亚砜；od：光密度或吸光度；ct：胆甾烷-3β,5α,6β-三醇；ocdo：6-氧代-胆甾烷-3β,5α-二醇；5,6α-ec：5,6α-环氧胆固醇；tam：三苯氧胺；tlc：薄层色谱法；叔丁基：叔丁基或式(ch3)3c-的叔丁基。
具体实施方式
[0033]
本发明首先涉及一种用于其用作药用产品的式(i)化合物；
或此类化合物的药学上可接受的盐，其中r1选自：-基团-c(o)nr2r3，其中r2、r3相同或不同，并且选自h和任选地含有一个或多个选自烯丙基、羰基和芳族杂环基团的取代基的直链或支链、饱和或不饱和c1-c8碳链，-基团-c(o)r4，其中r4选自-ch2ch3和-c5h
11
，-基团-c(o)or5，其中r5是直链或支链、饱和或不饱和的c1-c8碳链，-基团-c(o)chnh(coch2ch3)r6，其中r6是选自-ch
2-c3n2h2、ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-ch(ch3)2、-ch2c6h5、-ch2c8nh6、-(ch2)4nh2、-ch2c6oh5、-c3h5n的氨基酸的侧链。
[0034]
根据一个实施方式，本发明涉及一种用作其用于引起哺乳动物癌性肿瘤消退的药物的用途的式(i)化合物；或此类化合物的药学上可接受的盐，其中r1选自：-基团-c(o)nr2r3，其中r2、r3相同或不同，并且选自h和任选地含有一个或多个选自烯丙基、羰基和芳族杂环基团的取代基的直链或支链、饱和或不饱和c1-c8碳链，-基团-c(o)r4，其中r4选自-ch2ch3和-c5h
11
，-基团-c(o)or5，其中r5是直链或支链、饱和或不饱和的c1-c8碳链，-基团-c(o)chnh(coch2ch3)r6，其中r6是选自-ch
2-c3n2h2、ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-ch(ch3)2、-ch2c6h5、-ch2c8nh6、-(ch2)4nh2、-ch2c6oh5、-c3h5n的氨基酸的侧链。
[0035]
在式(i)化合物的一个实施方式中，基团r1是基团-c(o)r4(酰基基团)，其中r4是选自-ch2ch3和-c5h
11
的基团。在式(i)化合物的该实施方式中，基团r4优选地是基团-ch2ch3，它是化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-丙酸酯。丙酸酯(propionate)与丙酸酯(propanoate)相同。在式(i)化合物的另一个优选实施方式中，基团r4是-c5h
11
，它是化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-己酸酯。
[0036]
在式(i)化合物的另一个实施方式中，基团r1是基团-c(o)or5(碳酸酯基团)，其中r5是c1-c8碳链。在式(i)化合物的该实施方式中，基团r5优选地是乙基或丁基碳链，非常优选地是乙基碳链。
[0037]
在式(i)化合物的又一个实施方式中，基团r1是基团-c(o)nr2r3(氨基甲酸酯基团)，其中r2和r3相同或不同，并且选自h和任选地含有芳族杂环取代基的线性饱和c1-c8碳链。在式(i)化合物的优选实施方式中，r2和r3选自两个乙基基团或基团1-h-咪唑-4-基。在式(i)化合物的一个非常优选的实施方式中，r2和r3表示芳族杂环取代基，例如基团1-h-咪唑-4-基。
[0038]
在式(i)化合物的一个实施方式中，r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)r6，其中r6是选自-ch
2-c3n2h2、ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-ch(ch3)2、-ch2c6h5、-ch2c8nh6、-(ch2)4nh2、-ch2c6oh5、-c3h5n的氨基酸的侧链。
[0039]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch2c3n2h时，它是化合物n-丙酸酯-l-组氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0040]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch(ch3)ch2ch3时，它是化合物n-丙酸酯-l-异亮氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0041]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch2ch(ch3)2时，它是化合物n-丙酸酯-l-亮氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0042]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)(ch2)4nh2时，它是化合物n-丙酸酯-l-赖氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0043]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch2c6h5时，它是化合物n-丙酸酯-l-苯丙氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0044]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch2c8nh6时，它是化合物n-丙酸酯-l-色氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0045]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch2c6h4oh时，它是化合物n-丙酸酯-l-酪氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3
β-基酯。
[0046]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)ch(ch3)2时，它是化合物n-丙酸酯-l-缬氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0047]
在式(i)化合物的该实施方式中，当基团r1是基团-c(o)chnh(coch2ch3)c3h5n时，它是化合物n-丙酸酯-l-脯氨酸α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0048]
根据本发明的优选的化合物选自：-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-丙酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-己酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基1-h-咪唑-4-基乙基氨基甲酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基二乙基氨基甲酸酯；-n-丙酸酯-l-组氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-亮氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-异亮氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-缬氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-苯丙氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-色氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-赖氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-酪氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯；-n-丙酸酯-l-脯氨酸α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0049]
根据本发明的非常优选的化合物选自：-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-丙酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-己酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基1-h-咪唑-4-基乙基
氨基甲酸酯；-5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基二乙基氨基甲酸酯；-n-丙酸酯-l-酪氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯。
[0050]
根据一个实施方式，式(i)化合物旨在用作用于治疗乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫癌、宫颈癌、口腔癌、脑癌、胃癌、肝癌、咽喉癌、喉癌、食管癌、骨癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、视网膜癌、静脉窦癌、鼻腔癌、睾丸癌、甲状腺癌、外阴癌的药物，旨在用于治疗淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、急性髓细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、merkel细胞癌或间皮瘤的药物。
[0051]
根据一个实施方式，所述癌症是腺泡腺癌、腺泡癌、肢端雀斑样痣黑色素瘤(acro-lentiginous melanoma)、光化性角化病、腺癌、囊性腺样癌、腺鳞癌、附件癌、肾上腺静止肿瘤、肾上腺皮质癌、醛固酮分泌癌、肺泡软组织肉瘤、甲状腺成釉细胞癌、血管肉瘤、大汗腺癌(apocrine carcinoma)、阿斯金瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、胆管癌、骨髓癌、葡萄状肉瘤、细支气管肺泡癌、支气管原腺癌、支气管原癌、外多形性腺瘤癌、绿色瘤、胆管细胞癌、软骨肉瘤、绒毛膜癌、脉络丛癌、透明细胞腺癌、结肠癌症、粉刺性癌、皮质醇生成癌、柱状细胞癌、分化脂肪肉瘤、前列腺导管腺癌、导管癌、原位导管癌、十二指肠癌、分泌腺癌、胚胎癌、子宫内膜癌、子宫内膜间质癌、上皮样肉瘤、尤因氏肉瘤、外生型癌、成纤维细胞肉瘤、纤维癌、纤维板层癌、纤维肉瘤、滤泡状甲状腺癌、胆囊癌、胃腺癌、巨细胞癌、巨细胞肉瘤、巨细胞骨肿瘤、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、粒细胞癌、头颈部癌、血管瘤、血管内皮瘤、肝母细胞癌、肝细胞癌、许特尔氏细胞癌(h
ü
rthle cell carcinoma)、回肠癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、导管内癌、表皮内癌、空肠癌、卡波济氏肉瘤、库肯勃瘤、kulchitsky细胞癌、库普弗细胞肉瘤、大细胞癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、脂肪肉瘤、小叶癌、原位小叶癌、淋巴上皮癌、淋巴肉瘤、恶性黑色素瘤、髓样癌、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、脑膜癌、微乳头状癌、混合细胞肉瘤、粘液癌、粘液表皮样癌、粘膜黑素瘤、粘液样脂肪肉瘤、黏液肉瘤、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、结节性黑色素瘤、非透明细胞肾癌、非小细胞性肺癌、燕麦细胞癌、眼睛黑色素瘤、口腔癌、骨样癌、骨肉瘤、卵巢癌、佩吉特氏癌、胰母细胞瘤、乳头状腺癌、乳头状癌、乳头状甲状腺癌、盆腔癌、壶腹周围癌、叶状瘤、垂体癌、多形性脂肪肉瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性骨内癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、圆形细胞脂肪肉瘤、瘢痕癌、血吸虫膀胱癌、施奈德氏癌、皮脂腺癌、环状细胞癌、皮肤癌、小细胞肺癌、小细胞骨肉瘤、软组织肉瘤、梭形细胞肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑色素瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、终末导管癌、睾丸癌、甲状腺癌、移行细胞癌、小管癌、致肿瘤性黑色素瘤、未分化癌、尿道腺癌、膀胱癌、子宫癌、子宫体癌、子宫黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、绒毛状癌、高分化型脂肪肉瘤、维尔姆斯氏瘤(wilms’tumor)或生殖细胞瘤。
[0052]
在优选实施方式中，式(i)化合物旨在用作治疗哺乳动物中的乳腺癌、髓样白血病和黑色素瘤的药物。
[0053]
根据一个实施方式，所述化合物旨在用作治疗化学敏感性癌症的药物。
[0054]
根据特别优选的实施方式，式(i)化合物旨在用作治疗耐药性癌症的药物。
[0055]
根据一个实施方式，耐药性癌症是血液学癌症或血液癌症，例如白血病，特别地是
急性髓样白血病或急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤，特别地是非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0056]
根据一个实施方式，癌症对道诺霉素、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、顺铂、全反式维甲酸、三氧化二砷、硼替佐米或其组合具有耐药性。
[0057]
本说明书中所述的化合物树状配基a的特异性c3前药显示出与树状配基a相当或更大的药理学活性。树状配基a在体内被身体迅速消除。根据本发明的特异性c3前药的生物利用度大于树状配基a，并且在体内容易代谢为生物活性化合物。因此，当在体内使用本说明书中描述的特异性c3前药时，树状配基a在患者体内的治疗效果延长。
[0058]
所有对式(i)化合物的引用包括对盐、多组分复合物及其液晶的引用。所有对式(i)化合物的引用也包括对多晶型物及其通常晶体的引用。
[0059]
根据本发明的化合物可以呈药学上可接受的盐的形式。式(i)化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐。
[0060]
合适的酸盐由形成无毒盐的酸形成。例如，所述盐选自：乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、樟脑磺酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐(camsylate)、柠檬酸盐、环磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、氯化物盐酸盐、氢溴酸盐、溴化物、氢碘化物、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐和昔萘酸盐。优选地，式(i)化合物的药学上可接受的盐由乳酸盐形成。
[0061]
式(i)化合物的药学上可接受的盐可以通过以下三种方法中的一种或多种制备：(i)通过使式(i)化合物与所需的酸反应；(ii)通过在式(i)化合物的合适的前体的酸性或碱性介质中消除不稳定的保护基，或通过使用所需酸使合适的环状前体，例如内酯或内酰胺开环；或(iii)通过与酸反应或通过合适的离子交换柱将式(i)化合物的盐转化为另一种盐。
[0062]
这三种反应通常在溶液中进行。所获得的盐可以沉淀并且可以通过过滤收集，或者可以通过溶剂蒸发回收。所获得的盐的电离程度可以从完全电离到几乎未电离不等。
[0063]
本发明其次涉及一种用于其作为用于引起哺乳动物癌性肿瘤消退的药物的用途的药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含至少一种如上所述的根据本发明的化合物。
[0064]
根据一个实施方式，所述药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。
[0065]
根据优选实施方式，所述另外的治疗剂是抗肿瘤剂。
[0066]
根据一个实施方式，抗肿瘤剂是一种损伤dna的药剂，例如喜树碱、伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、苏消安或噻替派，抗肿瘤抗生素例如道诺霉素、阿霉素、表柔比星、依达比星、米托蒽醌、戊柔比星、放线菌素d、丝裂霉素、博来霉素或普卡霉素，抗代谢药例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氟达拉滨或甲氨蝶呤，抗有丝分裂剂例如紫杉醇、多西他赛、长春花碱、
长春新碱、长春地辛或长春瑞滨，或各种抗肿瘤剂例如硼替佐米、全反式维甲酸、三氧化二砷或其组合产物。
[0067]
根据一个实施方式，当药物组合物未与根据本发明的化合物联合施用时，该药物组合物用于患有对所述抗肿瘤剂具有耐药性的肿瘤的患者的癌症治疗。
[0068]
根据一个实施方式，所述药物组合物用于对患有对所述抗肿瘤剂化学敏感的肿瘤的患者进行癌症治疗，并且与根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐联合施用给所述患者的抗肿瘤剂的剂量低于抗肿瘤剂未与根据本发明的化合物联合施用时的抗肿瘤剂的剂量。特别地，与根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐联合施用于所述患者的抗肿瘤剂的剂量低于在没有任何另外的活性成分的情况下单独施用的抗肿瘤剂的剂量。
[0069]
根据本发明的药物组合物还可以进一步包含通常用于治疗上述病理的其它活性治疗化合物。
[0070]
根据一个实施方式，所述药物组合物包含根据本发明的化合物作为唯一的治疗剂。
[0071]
根据一个实施方式，所述药物组合物包含作为活性治疗剂被施用于患者的式(i)化合物。
[0072]
根据一个实施方式，所述药物组合物包含与至少一种其它活性治疗剂联合施用于患者的式(i)化合物。
[0073]
根据一个实施方式，本发明的药物组合物可以通过所有途径施用，特别地通过以下途径：使用作为片剂、胶囊剂、溶液剂、散剂、凝胶剂、颗粒剂的制剂经皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺、跨粘膜(口服、鼻内、阴道内、直肠)、经鼻喷雾吸入；被包含在注射器、植入装置、渗透泵、药筒、微型泵中；或本领域公知的胜任的专业人员所理解的任何其他方式。例如通过以下途径可以进行部位处特异性施用：以包含通常无毒且药学上可接受的载体的合适剂量在肿瘤内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮施用。优选地，所述药物组合物呈适于静脉内、皮下、腹膜内或口服施用的形式，口服途径是特别优选的
[0074]
除了热血动物例如小鼠、大鼠、狗、猫、羊、马、牛和猴外，本发明的化合物对人也有效。
[0075]
根据一个实施方式，用于施用本发明的化合物的药物组合物可以以单位剂量形式存在，并且可以通过现有技术中公知的任何方法制备。所有方法都包括将活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体组合的步骤。通常，药物组合物是通过如下制备的：将活性成分与液体载体或细碎固体载体或两者组合放置，然后，如果需要，将产品形成为所需的制剂。在药物组合物中，活性成分的化合物以用于对疾病进展或状态产生所需效果的足够的量被包含。含有活性成分的药物组合物可以呈适于口服使用的形式，例如呈片剂、含片、水性或油性混悬剂、分散性散剂或颗粒剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、酏剂、溶液剂、口腔贴剂、口服凝胶剂、咀嚼口香糖剂、咀嚼片剂、泡腾散剂和泡腾片剂的形式。含有活性成分的药物组合物可以呈水性或油性混悬剂的形式。
[0076]
根据一个实施方式，水性混悬剂含有与合适的赋形剂混合的活性物质，所述合适
的赋形剂用于制备水性悬浮物。这些赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然磷脂例如卵磷脂、或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如十七烷亚乙基-氧基缩酮醇(heptadecaethylene-oxyketanol))、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸类和己醇酸酐的部分酯的缩合产物(例如聚乙烯山梨醇单油酸酯)。水性混悬剂还可以含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙基)、一种或更多种着色剂、一种或者更多种调味剂、以及一种或更多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。
[0077]
根据一个实施方式，油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬质石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂(例如上述甜味剂)和调味剂，以得到具有宜人口感的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。适用于通过加水制备水性混悬剂的分散性散剂和分散性颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。
[0078]
糖浆剂和酏剂可以用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制。这些制剂也可以含有润肤剂、防腐剂、调味剂和着色剂。
[0079]
根据本发明的药物组合物可以呈用于无菌注射的水性或油性混悬剂的形式。该混悬剂可以根据已知技术使用上述合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂进行配制。可注射无菌制剂也可以是通过肠胃外途径在可接受的无毒溶剂中的可注射无菌溶液或混悬剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂包括：水、林格氏流体和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何固定油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸用于制备可注射产品。
[0080]
根据本发明的药物组合物也可以以栓剂的形式施用，用于药物产品的直肠施用。这些组合物可以通过将药物产品与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述无刺激性赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物产品。这些材料包括可可脂和聚乙二醇。
[0081]
此外，根据本发明的药物组合物可以通过溶液剂或软膏剂的方式通过眼部途径施用。此外，所讨论的化合物的经皮施用可以通过离子电渗贴剂等实现。对于局部敷用，可使用乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂或混悬剂。
[0082]
在治疗患有癌症或处于患癌症风险的哺乳动物时，根据本发明的药物组合物的合适剂量可以通常为每天每千克患者体重约0.1至50000微克(μg)，其可以以单剂量或多剂量施用。取决于许多因素，例如待治疗癌症的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、施用途径和形式，剂量水平优选地为每天约1000至约40000μg/kg。对于口服施用，该组合物可以片剂的形式提供，该片剂含有1000至100000微克的每种活性成分，特别地1000、5000、10000、15000、20000、25000、50000、75000或100000微克的每种活性成分。该组合物可以以每天1至4次，例如每天一次或两次的方案施用。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。
[0083]
在下文中，本发明还公开了制备式(i)化合物的方法。
附图说明
[0084]
根据以下参考附图对本发明的多个特定实施方式的描述，将更好地理解本发明，并且本发明的其他目的、细节、特征和优点将变得更加清晰，所述特定实施方式仅用于说明而非限制。
[0085]
图1示出了与化合物树状配基a(dx101)相比，化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯(dx107)的药代动力学特征。
[0086]
图2示出了与化合物树状配基a(dx101)相比，化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯(dx117)的药代动力学特征。
[0087]
图3示出了与化合物树状配基a(dx101)相比，化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-乙基-碳酸酯(dx121)的药代动力学特征。
[0088]
图4a示出了dx107与dx101之间在减少肿瘤生长方面的活性比较。
[0089]
图4b示出了dx107与dx101之间在动物存活率的方面的活性比较。
[0090]
图5示出了通过台盼蓝测定的化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯对neuro2a细胞的细胞毒性研究结果。
[0091]
图6示出了在化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯存在下对mcf-7乳腺肿瘤细胞进行的mtt细胞存活率测试的结果。
[0092]
图7示出了在化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯存在下mcf-7细胞中胆固醇环氧化物水解酶(cheh)活性的结果。
[0093]
实施例
[0094]
进行了各种实验来评价式(i)化合物的特性。以下实施例中使用的术语“环境温度”应解释为10至40摄氏度(℃)之的温度，例如15℃至30℃，优选地约20℃。
[0095]
对应于通式i的根据本发明的优选化合物，其合成和活性在下文中描述述，如下：
[0096]
在通式范围内的其它化合物(未例示)形成根据本发明的化合物的不可或缺的部分。
[0097]
实施例1：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酸酯(称为dx107，碱性形式)的合成：第一步是合成化合物胆甾烷-3β-丙酸酯，包括以下步骤：
在带有磨口颈的100ml烧瓶中，向4.00g胆固醇(10.3mmol)中加入10.0ml无水吡啶(123.6mmol)。加入7.07g丙酸酐(54.3mmol)，并将整体在室温搅拌24小时。在24小时结束时，在混合物中出现白色沉淀物。通过加入50ml甲醇(meoh)停止反应，得到大量白色沉淀物。将溶液过滤，并用meoh洗涤沉淀物。该过程得到4.50g白色粉末，对应于胆甾烷-3β-丙酸酯(产率89％)。3β-丙酸酯-胆甾烷在没有额外纯化的情况下按原样使用。1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)5.37-5.36(d,1h),4.64-4.58(m,1h),2.32-2.27(m,4h),2.02-1.95(t,2h),1.86-1.79(m,3h),1.61-1.81(m,27h),0.92-0.90(d,3h),0.87-0.85(d,6h),0.67(s,3h)。第二步包括从胆甾烷-3β-丙酸酯开始合成化合物5,6α-环氧胆甾烷-3-β-丙酸酯，如下：将间氯过氧苯甲酸(m-cpba)(以77％，2.67g，11.9mmol)溶于二氯甲烷(60ml)中，并在1小时的时间内内滴加到溶于二氯甲烷(20ml)中的胆甾烷-3β-丙酸酯(4.00g，9.03mmol)的混合物中。在室温保持搅拌三个小时。将反应混合物用na2s2o3水溶液(10重量％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂，得到4.08g白色粉末，对应于如下两种异构体的混合物：5,6α-环氧胆甾烷-3β-丙酸酯(73％)和5,6β-环氧胆甾烷-3β-乙酸酯(27％)。白色粉末在没有额外纯化的情况下按原样使用。1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)4.99-4.93(q,1h),2.89-2.88(d,1h),2.31-2.25(m,2h),2.18-2.13(t,1h)2.00-1.77(m,4h),1.70-0.94(m,29h),0.89-0.88(d,3h),0.86-0.85(d,6h),0.60(s,3h)。第三步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-丙酸酯(碱性形式的dx107)：在3.00g 5,6α-环氧胆甾烷-3β-丙酸酯(73％，4.6mmol)将完全溶解在30ml丁醇中后，加入碱性形式的组胺(1.44g，13.0mmol)。将反应混合物在回流下搅拌48小时。通过薄层色谱法(tlc)监测反应的进展，以监测5,6α-环氧胆甾烷-3β-丙酸酯的转化率。冷却后，将反
应混合物在24ml甲基叔丁基醚中稀释，将有机相用24ml水洗涤两次，然后用饱和nacl溶液洗涤两次。将有机相经无水mgso4干燥。将粗反应产物在自动净化器上的硅胶色谱柱中进行纯化。所使用的洗脱液是100-0％至0-100％的二氯甲烷/乙酸乙酯混合物。得到1.20g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酸酯的白色粉末，对应于46％的产率。1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.60(s,1h),6.85(s,1h),5.21-5.15(q,1h),2.94-2.89(m,1h),2.77-2.69(m,3h),2.39(s,1h),2.34-2.29(m,2h),2.12-2.07(t,1h),2.01-1.99(bd,2h),1.89-1.79(m,2h),1.70-1.01(m,29h),0.94-0.93(d,3h),0.9-0.89(dd,6h),0.69(s,3h)。实施例2：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酸酯的二乳酸盐(二乳酸盐形式的dx107)的制备：如下制备化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酸酯的二乳酸盐：、在搅拌下，将384mg乳酸(4.3mmol)加入到1.20g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酸酯(2.1mmol)在20ml无水乙醇中的溶液中。在室温保持搅拌3小时。真空蒸发有机溶剂，得到1.58g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-丙酸酯二乳酸盐的白色粉末。1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.61(s,1h),6.85(s,1h),5.04-4.98(q,1h),3.93-3.89(q,2h),3.43-3.42(q,1h),3.25-3.20(m,1h),3.12-3.06(q,1h),2.15-2.09(m,3h),1.87-1.85(d,1h),1.69-1.67(m,3h),1.61-1.05(m,4h),1.41-0.82(m,33h),0.76-0.75(d,3h),0.69-0.68(d,6h),0.57(s,3h)。
[0098]
实施例3：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基己酸酯(称为dx113，碱性形式)的合成：第一步是合成化合物胆甾烷-3β-己酸酯，包括以下步骤：在带有磨口颈的100ml烧瓶中，将4.00g(10.3mmol)胆固醇溶于10ml无水吡啶(123.6mg)中，并加入11.64g己酸酐(54.3mmol)。将整体在室温搅拌24小时。在24小时结束时，在混合物中出现白色沉淀物。通过加入50ml甲醇(meoh)停止反应，并得到大量白色沉淀物。将溶液过滤，并用meoh洗涤沉淀物。该过程得到4.95g白色粉末，对应于胆甾烷-3β-己酸
酯(产率99％)。胆甾烷-3β-己酸酯在没有额外纯化的情况下按原样使用。
[0099]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)5.38(s,1h),4.64-4.58(m,1h),2.32-2.25(m,4h),2.02-1.95(m,2h),1.86-1.84(m,3h),1.63-0.86(m,42h),0.67(s,3h)。
[0100]
第二步包括从胆甾烷-3β-己酸酯开始合成化合物5,6α-环氧胆甾烷-3-β-己酸酯，如下：
[0101]
将间氯过氧苯甲酸(m-cpba)(77％，2.95g，17.1mmol)溶于二氯甲烷(60ml)中，并在1小时的时间内滴加到胆汁甾-3β-己酸酯(4.90g，10.1mmol)在二氯甲烷(20ml)的溶液中。在室温保持搅拌3小时。将反应混合物用na2s2o3水溶液(10重量％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂得到5.06g白色粉末，对应于5,6α-环氧胆甾烷-3β-己酸酯(70％)和5,6β-环氧胆甾烷-3β-己酸酯(30％)。5,6α-环氧胆甾烷-3β-己酸酯在没有额外纯化的情况下按原样使用。
[0102]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)4.99-4.93(q,1h),2.89-2.88(d,1h),2.26-2.23(m,2h),2.18-2.13(t,1h),2.00-0.85(m,48h),0.60(s,3h)。
[0103]
第三步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-己酸酯(碱性形式的dx113)：
[0104]
将碱性形式的组胺(1.25g，11.2mmol)加入5,6α-环氧胆甾烷-3β-己酸酯(以纯度70％，4.0g，5.6mmol)的丁醇溶液(40ml)中。将反应混合物在回流下搅拌48小时。通过薄层色谱法(tlc)监测反应的进展，以监测5,6α-环氧胆甾烷-3β-己酸酯的转化率。冷却后，将反应混合物在40ml甲基叔丁基醚中稀释，将有机相用40ml水洗涤三次，然后用40ml饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。将粗反应产物在自动净化器上的硅胶色谱柱中进行纯化。所使用的洗脱液是100-0％至0-100％的二氯甲烷/乙酸乙酯混合物。得到1.71g5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-己酸酯的白色粉末(50％产率)。
[0105]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.59(s,1h),6.85(s,1h),5.22-5.16(q,1h),2.94-2.89(m,1h),2.77-2.67(m,3h),2.39(s,1h),2.30-2.28(t,2h),2.14-2.10(t,1h),2.01-1.99(bd,1h),1.88-0.89(m,47h),0.69(s,3h)。
[0106]
实施例4：化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基己酸酯的二乳酸盐(二乳酸盐形式的dx113)的制备：
[0107]
如下制备化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基己酸酯的二乳酸盐：
在搅拌下，将552mg乳酸(6.15mmol)加入到1.87g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基己酸酯(3.06mmol)在5ml无水乙醇中的溶液中。在室温保持搅拌3小时。真空蒸发有机溶剂，得到2.42g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基己酸酯二乳酸盐的白色粉末。
[0108]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.56(s,1h),6.78(s,1h),4.93-4.87(q,1h),3.84-3.82(d,2h),3.33-3.32(m,1h),3.13(bs,1h),3.02(bs,1h),2.75-2.69(m,3h),2.08-2.05(m,3h),1.78-1.76(d,1h),1.61-0.59(m,50h),0.48(s,3h)。
[0109]
实施例5：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯(称为dx121，碱性形式)的合成：
[0110]
第一步包括从市售产品胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯开始合成化合物5,6α-环氧胆甾烷-3-β-基乙基碳酸酯，如下：将间氯过氧苯甲酸(m-cpba)(以77％，1.31g，5.8mmol)溶于二氯甲烷(30ml)中，并在30分钟的时间内滴加到溶于二氯甲烷(15ml)中的胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯(2.02g，4.4mmol)的混合物中。在室温保持搅拌三个小时。将反应混合物用亚硫酸钠水溶液(10重量％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂得到2.09g白色粉末，对应于如下两种异构体的混合物：5,6α-环氧胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯(76％)和5,6β-环氧胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯(24％)。白色粉末在没有额外纯化的情况下按原样使用。
[0111]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)4.85-4.78(q,1h),2.90-2.89(d,1h),2.23-2.19(t,1h),2.09-2.04(m,1h),1.98-1.87(m,2h),1.84-0.93(m,32h),0.89-0.87(d,3h),0.86-0.84(d,6h),0.60(s,3h)。
[0112]
第二步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯：
[0113][0114]
在2.09g 5,6α-环氧胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯(以76％，3.4mmol)在20ml丁醇中完全溶解后，加入碱性形式的组胺(754.5mg，6.8mmol)。将反应混合物在回流下搅拌48小时。通过薄层色谱法(tlc)监测反应的进展，以监测5,6α-环氧胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯的转化率。冷却后，将反应混合物在20ml甲基叔丁基醚中稀释，并将有机相用20ml饱和nacl溶液洗涤3次。将有机相经无水mgso4干燥。将粗反应产物在自动净化器上的硅胶色谱柱中进行纯化。所使用的洗脱液是100-0％至0-100％的二氯甲烷/乙酸乙酯混合物。得到480mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯的白色粉末，对应于24％的产率。
[0115]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.54(s,1h),6.80(s,1h),5.00-4.93(q,1h),2.89-2.84(m,1h),2.73-2.62(m,3h),2.36(s,1h),2.08-2.03(t,1h),1.96-1.94(d,1h)1.83-1.79(m,2h),1.66-0.97(m,32h),0.90-0.89(d,3h),0.85-0.84(dd,6h),0.64(s,3h)。
[0116]
实施例6：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯的二乳酸盐(二乳酸盐形式的dx121)的制备：
[0117]
如下制备化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯的二乳酸盐：在搅拌下，将141.6mg乳酸(1.57mmol)加入460mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯(0.785mmol)在8ml无水乙醇中的溶液中。在室温保持搅拌3小时。真空蒸发有机溶剂，得到1.58g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基乙基碳酸酯二乳酸盐的白色粉末。
[0118]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.57(s,1h),6.76(s,1h),4.74-4.70(q,1h),3.84-3.78(q,4h),3.31-3.27(m,2h),3.13-3.08(m,1h),2.99-2.94(m,1h),2.73-2.67(m,3h),2.04-2.00(t,1h),1.75-1.72(d,1h),1.64-1.39(m,8h),1.28-0.69(m,28h),0.64-0.63(d,3h),0.57-0.56(d,6h),0.45(s,3h)。
[0119]
实施例7：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯的合成(称为dx119，碱性形式)：
[0120]
第一步包括从市售产品胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯开始合成化合物5,6α-环氧胆甾
烷-3-β-基丁基碳酸酯，如下：
[0121]
将间氯过氧苯甲酸(以77％，1.28g，5.7mmol)溶解在二氯甲烷(30ml)中，并在30分钟的时间内滴加到溶于二氯甲烷(15ml)中的胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯(2.14g，4.4mmol)的混合物中。在室温保持搅拌三个小时。将反应混合物用na2s2o3水溶液(10重量％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂得到2.21g白色粉末，对应于如下两种异构体的混合物：5,6α-环氧胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯(77％)和5,6β-环氧胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯(23％)。白色粉末在没有额外纯化的情况下按原样使用。
[0122]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)4.86-4.79(q,1h),2.91-2.89(d,1h),2.22-2.18(t,1h),2.09-2.04(m,1h),1.98-1.87(m,2h),1.84-0.93(m,33h),0.89-0.87(d,6h),0.86-0.84(d,6h),0.60(s,3h)。
[0123]
第二步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯(碱性形式的dx119)：
[0124]
在2.21g 5,6α-环氧胆甾烷-3β-丁基碳酸酯(以77％，3.4mmol)在20ml丁醇中完全溶解后，加入碱性形式的组胺(759.8mg，6.8mmol)。将反应混合物在回流下搅拌48小时。通过薄层色谱法(tlc)监测反应的进展，以监测5,6α-环氧胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯的转化率。冷却后，将反应混合物在20ml甲基叔丁基醚中稀释，并将有机相用20ml饱和nacl溶液洗涤3次。将有机相经无水mgso4干燥。将粗反应产物在自动净化器上通过柱色谱法进行纯化。所使用的洗脱液是100-0％至0-100％的二氯甲烷/乙酸乙酯混合物。得到814mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯的白色粉末，对应于39％的产率。
[0125]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.54(s,1h),6.80(s,1h),5.00-4.93(q,1h),4.06-4.03(m,2h),2.91-2.87(m,1h),2.73-2.65(m,3h),2.39(s,1h),2.09-2.05(t,1h),1.96-1.93(d,1h)1.84-1.77(m,2h),1.66-0.96(m,31h),0.92-0.88(m,6h),0.85-0.83(dd,6h),0.64(s,3h)。
[0126]
实施例8：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯的二乳酸盐的制备(二乳酸盐形式的dx119)：
[0127]
如下制备化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯的二乳酸盐：
在搅拌下，将33.7mg乳酸(0.37mmol)加入114mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯(0.186mmol)在2ml无水乙醇中的溶液中。在室温保持搅拌3小时。真空蒸发有机溶剂，得到148mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丁基碳酸酯二乳酸盐的白色粉末。
[0128]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.70(s,1h),6.97(s,1h),5.02-4.95(q,1h),4.08-4.03(q,4h),3.37-3.35(m,1h),3.26-3.20(m,1h),2.95(s,1h),2.87(s,1h),2.31-2.26(t,2h),2.02-1.99(d,1h),1.92-0.94(m,39h),0.90-0.88(m,6h),0.84-0.82(dd,6h),0.72(s,3h)。
[0129]
实施例9：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯(称为dx117，碱性形式)的合成：
[0130]
第一步是合成化合物胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯，包括以下步骤：
[0131][0132]
在带有磨口颈的100ml烧瓶中，加入20ml二氯甲烷以溶解7.58g胆固醇(19.6mmol)和1.0g 4-二甲氨基吡啶(dmap，8.2mmol)。然后加入15ml无水吡啶(185.5mmol)和3.4ml氯甲酸苯酯(24.1mmol)，并将整体在室温搅拌1小时。在一小时结束时，通过加入35ml二氯甲烷稀释反应混合物，并用70ml hcl(1m)水溶液洗涤反应混合物三次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂得到8.79g对应于所需产物的白色粉末，对应于98％的产率。
[0133]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)7.31-7.28(m,2h),7.17-7.13(m,1h),7.12-7.10(d,2h),5.35-5.34(q,1h),4.54-4.47(m,1h),2.45-2.36(m,2h),1.98-1.61(m,6h),1.54-0.88(m,23h),0.85-0.84(d,3h),0.80-0.78(d,6h),0.61(s,3h)。
[0134]
第二步包括从胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯开始合成化合物5,6α-环氧胆甾烷-3-β-基苯基碳酸酯，如下：将间氯过氧苯甲酸(以77％，5.08g，22.7mmol)溶于二氯甲烷(70ml)中，并在1小时的时间内滴加到溶于二氯甲烷(70ml)中的胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯(8.79g，17.3mmol)的
混合物中。在室温保持搅拌三个小时。将反应混合物用na2s2o3水溶液(10wt％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂得到9.04g澄清油状物，对应于如下两种异构体的混合物：5,6α-环氧胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯和5,6β-环氧胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯。将混合物再溶于10ml et2o中，并加入40ml etoh以获得白色沉淀物。将溶液过滤，并用etoh洗涤沉淀物。该过程得到7.23g富含5,6α-环氧-胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯的白色粉末，对应于89％产率的88％(76％对映体过量)。
[0135]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)7.38-7.35(m,2h),7.24-7.21(m,1h),7.18-7.16(d,2h),4.96-4.90(q,1h),2.93(s,1h),2.33-2.29(t,1h),2.18-2.15(d,1h),1.97-1.90(m,2h),1.84-1.74(m,3h),1.58-0.95(m,24h),0.90-0.88(d,3h),0.87-0.85(dd,6h),0.61(s,3h)。
[0136]
第三步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯(碱性形式的dx117)：
[0137]
在1.0g 5,6α-环氧-胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯(88％，1.7mmol)完全溶于30ml丁醇后，加入碱性形式的组胺(1.13g，10.2mmol)。将反应混合物在回流下搅拌48小时。通过薄层色谱法(tlc)监测反应的进展，以监测5,6α-环氧胆甾烷-3β-基苯基碳酸酯的转化率。将混合物转移到分液漏斗中，并将有机产物用15ml甲基叔丁基醚萃取两次，再用15ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相合并，并经无水mgso4干燥。将粗反应产物在自动净化器上的硅胶色谱柱中进行纯化。所使用的洗脱液是95-5％至80-20％的乙酸乙酯-meoh的混合物，且最终是75-20-5％的dcm-meoh-nh4oh。得到530mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯的白色粉末，对应于48％的产率。
[0138]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.60(s,1h),7.58(s,1h),6.86(s,1h),6.83(s,1h),5.02-4.95(q,1h),3.31-3.30(m,2h),2.99-2.97(m,1h),2.77-2.74(m,5h),2.45(s,1h),2.09-2.05(t,1h),2.00-1.98(d,1h),1.86-1.81(m,2h),1.69-1.00(m,27h),0.93-0.92(d,3h),0.89-0.87(d,6h),0.69(s,3h)。
[0139]
实施例10：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯的三乳酸盐(三乳酸盐形式的dx117)的制备：如下制备化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯的三乳酸盐：
在搅拌下，将103.4mg乳酸(1.15mmol)加入到251.2mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯(0.39mmol)在5ml无水乙醇中的溶液中。在室温保持搅拌3小时。真空蒸发有机溶剂，得到1.58g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-(2-(1h-咪唑-4-基)乙基)氨基甲酸酯三乳酸盐的白色粉末。
[0140]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)8.20(s,1h),7.60(s,1h),6.96(s,1h),6.85(s,1h),4.85-4.78(m,1h),3.95-3.91(q,4h),3.43-3.39(q,1h),3.25-3.07(m,5h),2.84-2.83(m,2h),2.74(s,1h),2.68-2.65(m,2h),2.11-2.07(t,1h),1.86-1.84(d,1h),1.69-0.81(m,35h),0.75-0.74(d,3h),0.69-0.67(d,6h),0.57(s,3h)。
[0141]
实施例11：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基-二乙基氨基甲酸酯(称为dx131，碱性形式)的合成：
[0142]
第一步是合成化合物胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯，包括以下步骤：
[0143]
在带有磨口颈的100ml烧瓶中，将2.0ml无水吡啶(d＝0.978g/ml；24.7mmol)加入到溶于40ml二氯甲烷中的胆固醇氯甲酸酯(9.07g，20.2mmol)的混合物中。加入5.0ml二乙胺(d＝1.248g/ml；48.3mmol)，并将整体在室温搅拌过夜。将反应混合物用60ml二氯甲烷稀释，并用100ml 3.7体积％的hcl水溶液洗涤5次。将有机相经无水mgso4干燥，并在真空下蒸发有机溶剂。将白色固体用100ml et2o溶解并用100ml meoh沉淀，然后将溶液过滤并用冷meoh洗涤沉淀物。该过程得到9.30g白色粉末，对应于胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯(产率为95％)。
[0144]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)5.37-5.36(d,1h),4.54-4.49(m,1h),2.38-2.37(dd,1h),2.31-2.27(t,1h),2.02-1.80(m,5h),1.60-0.93(m,34h),0.92-0.91(d,3h),0.87-0.86(d,6h),0.67(s,3h)。
[0145]
第二步包括从胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯开始合成化合物5,6α-环氧胆甾烷-3-β-二乙基氨基甲酸酯，如下：
将间氯过氧苯甲酸(以77％，4.47g，19.9mmol)溶于二氯甲烷(100ml)中，并在1小时的时间内滴加到溶于二氯甲烷(50ml)中的胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯(7.45g，15.3mmol)的混合物中。在室温保持搅拌三个小时。将反应混合物用na2s2o3水溶液(10重量％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂，得到7.81g白色固体，对应于如下两种异构体的混合物：5,6α-环氧胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯(69％)和5,6β-环氧胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯(31％)。将白色固体溶解在50ml二氯甲烷中，加入100ml甲醇，以沉淀出4.27g富含5,6α-环氧胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯的白色粉末(86％)。
[0146]1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)4.88-4.83(q,1h),2.88(s,1h),2.16-2.13(t,1h)2.05-2.03(d,1h),1.97-0.93(m,39h),0.89-0.88(d,3h),0.86-0.85(d,6h),0.60(s,3h)。
[0147]
第三步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯(碱性形式的dx131)：
[0148]
在2.00g 5,6α-环氧胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯(86％，3.4mmol)完全溶于7ml丁醇后，加入碱性形式的组胺(756.3mg，6.8mmol)。将反应混合物在回流下搅拌48小时。通过薄层色谱法(tlc)监测反应的进展，以监测5,6α-环氧胆甾烷-3β-二乙基氨基甲酸酯的转化率。冷却后，将反应混合物在7ml甲基叔丁基醚中稀释，将有机相用7ml饱和nacl溶液洗涤3次。将有机相经无水mgso4干燥。将粗反应产物在硅胶色谱柱中进行纯化。所用的洗脱液是90-10％至0-100％的己烷-乙酸乙酯混合物，然后是90-10％至70-30％的乙酸乙酯-甲醇。得到0.45g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基二乙基氨基甲酸酯的白色粉末，对应于22％的产率。
[0149]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.61(s,1h),6.89(s,1h),5.07-5.01(q,1h),3.05-2.99(m,1h),2.82-2.79(m,3h),2.49(s,1h),2.19-2.14(t,1h),2.02-1.99(bd,1h),1.88-1.82(m,2h),1.73-0.96(m,37h),0.95-0.93(d,3h),0.90-0.88(dd,6h),0.70(s,3h)。
[0150]
实施例12：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基二乙基氨基甲酸酯的二乳酸盐(二乳酸盐形式的dx131)的制备：
[0151]
如下制备化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基二乙基氨基甲酸酯的二乳酸盐：
在搅拌下，将132.7mg乳酸(1.34mmol)加入449.1mg 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基-二乙基氨基甲酸酯(0.73mmol)在7.5ml无水乙醇中的溶液中。在室温保持搅拌3小时。真空蒸发有机溶剂，得到580.6g 5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基二乙基氨基甲酸酯二乳酸盐的白色粉末。
[0152]1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.66(s,1h),6.94(s,1h),5.01-4.95(q,1h),4.06-4.01(q,2h),3.53-3.49(m,1h),3.37-3.32(q,1h),3.22-3.17(m,6h),2.94-2.91(t,1h),2.86(bd,1h),2.29-2.25(t,1h)1.98-1.95(d,1h),1.84-0.92(m,40h),0.86-0.85(d,3h),0.80-0.78(d,6h),0.68(s,3h)。
[0153]
实施例13：式(i)化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸(称为dx133，碱性形式)的合成：
[0154]
第一步是从氨基酸酪氨酸开始合成n-丙酰基酪氨酸：在100℃环境下，在2.33g naoh(58.3mmol)和3.52g酪氨酸(62.1mmol)在60ml去离子水中完全溶解后，加入10ml丙酸酐(d＝1.01g/ml；77.7mmol)。将反应混合物在回流下搅拌3天(d)。在这段时间结束时，通过加入hcl中和反应，直到ph＝6，并将其转移到分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取三次。将由此获得的有机相合并并经mgso4干燥，然后蒸发，得到对应于n-丙酰基酪氨酸和未反应的丙酸酐的混合物的澄清油状物。将油状物用etoh溶解并在真空下干燥，得到3.81g的白色粉末(70％产率)。1h-nmr(500mhz,meod-4d):δ(ppm)7.03-7.01(d,2h),6.69-6.67(d,2h),4.59-4.56(m,1h),3.11-3.07(m,1h),2.86-2.81(m,1h),2.19-2.14(q,2h),1.04-1.01(t,3h)。
[0155]
第二步是胆固醇和n-丙酰基酪氨酸之间的酯化反应，得到化合物胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸
[0156]
将3.81g n-丙酰基酪氨酸(13.6mmol)、5.26g胆固醇(13.5mmol)和480mg对甲苯磺
酸一水合物酸(tsoh，1.39mmol)转移到100ml带有磨口颈的烧瓶中，并使其溶解在20ml甲苯中。将tsoh分两部分加入；在第一部分之后6小时加入第二部分。将反应混合物在回流下搅拌24小时。在这一天的反应结束时，通过加入naoh来中和反应，直到ph＝12。将混合物转移到分液漏斗中，并用乙酸乙酯萃取三次。将由此获得的有机相合并并经mgso4干燥，然后蒸发，得到棕白色固体。将粗反应产物在硅胶色谱柱中进行纯化。所使用的洗脱液是90-10％至30-70％的己烷/乙酸乙酯的混合物。得到7.83g胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸的棕白色固体，对应于96％的产率。1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)6.97-6.95(dd,2h),6.73-6.70(dd,2h),6.41(bs,1h),5.98-5.97(d,1h),5.38-5.36(t,1h),4.84-4.80(m,1h),4.66-4.60(m,1h),3.09-2.96(m,2h),2.36-2.19(m,4h),2.02-1.95(m,2h),1.88-1.79(m,3h),1.71-0.93(m,27h),0.92-0.91(d,3h),0.87-0.85(d,6h),0.68(s,3h)。
[0157]
第三步包括从胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸开始合成化合物5,6α-环氧胆甾烷-3-β-基丙酰基酪氨酸，如下：将间氯过氧苯甲酸(以77％，1.79g，8.0mmol)溶于二氯甲烷(45ml)中，并在30分钟的时间内滴加到溶于二氯甲烷(20ml)中的胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸(4.66g，7.7mmol)的混合物中。在室温保持搅拌三个小时。将反应混合物用na2s2o3水溶液(10重量％)洗涤两次，用nahco3饱和溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经无水mgso4干燥。真空蒸发有机溶剂得到6.29g油状物，对应于如下两种异构体的混合物：5,6α-环氧胆甾烷-3β-基丙酰基甘氨酸和5,6β-环氧胆甾烷-3β-基丙酰基甘氨酸。将混合物再溶于20ml二氯甲烷中，并加入80ml etoh，得到棕白色沉淀物。将所得的棕白色沉淀物过滤并用meoh洗涤。在用meoh洗涤期间，使白色粉末通过过滤器；将所得滤液在真空下干燥，得到4.33g富含5,6α-环氧胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸的白色粉末，对应于90％产率(36％对映体过量)。1h-nmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)6.95-6.93(dd,2h),6.73-6.71(dd,2h),6.48(bs,1h),4.99-4.92(m,1h),4.80-4.75(m,1h),3.07-2.89(m,4h),2.22-0.93(m,36h),0.89-0.88(d,3h),0.86-0.85(dd,6h),0.61(s,3h)。第四步包括如下合成5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)乙基氨基]胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸(碱性形式的dx133)：在1.0g 5,6α-环氧胆甾烷-3β-基丙酰基酪氨酸(63％，1.0mmol)在5ml丁醇中完全
丙酰基)-l-缬氨酸5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基酯的合成，包括以下步骤：-将各种氨基酸溶解在ch3cn中并加入试剂dmap和(boc)2o以保护它们的氨基基团，-在甲苯中通过tsoh催化通过fischer反应进行n-丙酸酯氨基酸与胆固醇的酯化，-连续的反应途径与为合成树状配基a而进行的步骤相同(见上文)。
[0161]
实施例16：dx107的药代动力学研究
[0162]
以下研究是在3天内在血浆中对各种分子进行的lc/ms测定(最终为11个测量点)。所述图表一直与作为参考的dx101进行比较而呈现。
[0163]
方案方案在0分钟(未注射)、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时进行血浆取样(11个点)
[0164]
dx101相比，dx107的药代动力学特征示出于图1中。结果如下： dx101dx107dx101，始于dx107曲线下面积14329789733159259最大浓度(nm)140142178达到c
最大
的时间(分钟)48060240
[0165]
结论：结果表明，与dx101相比，dx107在体内的吸收更快，且生物利用度更好。已经清楚地证明，dx101是一种前药，因为dx101在体内的存在增加了，使得可以提高治疗效果。
[0166]
实施例17：dx117的药代动力学研究
[0167]
以下研究是在3天内在血浆中对各种分子进行的lc/ms测定(最终为11个测量点)。所述图表一直与作为参考的dx101进行比较而呈现。
[0168]
方案 第1组第2组化合物的施用dx101dx117剂量50mg/kg50mg/kg应用途径口服口服动物大鼠大鼠组的大小33样品血浆血浆测定dx101dx117和dx101在0分钟(未注射)、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时进行血浆取样(11个点)
[0169]
[169]与dx101相比，dx117的药代动力学特征示于图2中。结果如下： dx101dx117dx101，始于dx117曲线下面积30192123502.5最大浓度(nm)15076.6713.33达到c
最大
的时间(分钟)4424
[0170]
结论：结果清楚地表明，dx117并且因此氨基甲酸酯衍生物是前药，因为dx101在体内的存在已得到证实。
[0171]
实施例18：dx121的药代动力学研究
[0172]
以下研究是在3天内在血浆中对各种分子进行的lc/ms测定(最终为11个测量点)。所述图表一直与作为参考的dx101进行比较而呈现。
[0173]
方案 第1组第2组化合物的施用dx101dx121剂量50mg/kg50mg/kg应用途径口服口服动物大鼠大鼠组的大小33样品血浆血浆测定dx101dx121和dx101在0分钟(未注射)、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时进行血浆取样(11个点)
[0174]
与dx101相比，dx121的药代动力学特征示于图3中。结果如下： dx101dx121dx101，始于dx121曲线下面积301910001590最大浓度(nm)15096.3391.33
达到c
最大
的时间(分钟)414
[0175]
结论：结果清楚地表明，dx121并且因此碳酸酯衍生物是前药，因为dx101在体内的存在已得到证实。
[0176]
实施例19：化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯或dx107的细胞毒性研究：对于该实验，制备了细胞培养基。培养基由包含4.5g/l葡萄糖和l-谷氨酰胺的dulbecco改良eagle培养基(dmem，由westburg以参考号lo be12-604f出售)组成，其中添加有10％胎牛血清(fcs)。将neuro2a细胞(小鼠神经母细胞瘤)引入该培养基中。以10000个neuro2a细胞/孔接种24孔板。在正常条件(即在37℃在5％ co2的情况下在培养箱中)下培养72小时(h)后，用100nm、1μm和10μm的5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基-丙酸酯和5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇处理neuro2a细胞48小时。也使用上述方案但在不使用上述化合物处理的情况下进行对照(ctl)。在使用biorad tc20装置(tc20
tm
自动细胞计数器)进行自动计数的情况下通过台盼蓝测定对细胞存活进行定量。台盼蓝测定基于细胞膜完整性，细胞膜在死细胞中被破坏。台盼蓝将死细胞染成蓝色。biorad tc20细胞计数器计算关于细胞百分比的蓝色细胞和非蓝色细胞的比例。结果示于图5中。图5在纵坐标上示出了相对于对照组的细胞存活百分比。在图5中示出了，与对照组(ctl)相比，对于用化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯和5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇以100nm进行的处理，活细胞的百分比保持不变。此外，对于浓度为1μm的5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇、5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯，细胞存活百分比分别为85.42％(标准差(sd)等于4.73(即85.42
±
4.73％))和84.08
±
4.09％。对于浓度为10μm的5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇、5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯，细胞存活百分比分别为43.25％
±
2.44和30.46
±
5.22％。总之，我们观察到式(i)化合物针对以下浓度对neuro2a肿瘤细胞具有细胞毒性活性：对于5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯的浓度为1μm，并且对于5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯的浓度为10μm。
[0177]
实施例20：化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯或dx107对mcf-7细胞存活率的作用：对mcf-7乳腺肿瘤细胞(密歇根州癌症基金会-7)进行了细胞存活率测试，该mcf-7乳腺肿瘤细胞过度表达含有雌激素受体的her2(er( )细胞)。使mcf-7细胞处于与实施例14相同的细胞培养基中，并以每孔50000个细胞/孔接种在12孔板中24小时。接种后24小时，用溶剂化物载体处理细胞，所述溶剂化物载体包含水和乙醇(其中乙醇比例为1
‰
)且包含以1μm、2.5μm或5μm的5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯或5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇。在倒置显微镜下观察细胞，并在24小时和48小时用显微镜相机拍摄。在1μm时，细胞的形态变化非常轻微。用5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇处
理24小时后，观察到一些白色囊泡。在本测试中：-白色囊泡反映细胞毒性自噬导致的细胞死亡；-变圆的细胞反映细胞死亡；-变得分离的细胞反映出细胞毒性作用；-粘附细胞反映细胞存活；-浮在表面的细胞反映细胞死亡；和-折射细胞反映细胞死亡。
[0178]
[表1]用5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇及其前药衍生物处理24小时和48小时后mcf7细胞的形态：上述观察结果表明，式(i)化合物对mcf-7细胞显示出细胞毒性活性。根据显微镜观察，所述化合物可以关于其导致细胞变圆和白色囊泡的活性进行分类：在24小时时：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇》5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯；在48小时时：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇》5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯。
[0179]
根据这些观察结果，通过在48小时时经mtt标记来测量细胞存活率测试。该测试基于四唑鎓盐mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)的使用。四唑鎓在
活性的活细胞中被线粒体琥珀酸脱氢酶还原为甲赞，甲赞是一种紫色的沉淀物。形成的沉淀物的量与活细胞的量成比例，而且也与每个细胞的代谢活性成比例。因此，通过光谱法简单地确定540nm处的光密度揭示了活细胞和代谢活性细胞的相对量。48小时后，吸取培养基，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞，然后用mtt(在pbs中为0.5mg/ml)温育约2小时。吸取mtt溶液，并将紫色晶体溶解于二甲基亚砜(dmso)中。在540nm处测量od(光密度)。
[0180]
该测定的结果呈现在图6中。图6在纵坐标上示出了相对于对照组的细胞存活率百分比。对照组与研究组类似地进行，其中不添加本文中研究的分子。与对照组相比，根据5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-乙氧基的剂量，在针对5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β基丙酸酯和5α-羟基-6β-[2-(1h咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇的mtt中测量到细胞存活率降低。对于2.5μm的浓度，观察到对于mcf-7细胞，细胞存活率相对于对照组降低。相对于对照组相，用化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇处理导致细胞存活率接近60％。对于化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯，细胞存活率为约95％。总之，对于用2.5μm浓度的处理，得到以下疗效顺序：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇》5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯。对于5μm浓度的处理，观察到对于mcf-7细胞，细胞存活率相对于对照组降低。对于用化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇、5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯的处理，细胞存活率为约18％。总之，对于浓度为5μm的处理，得到以下疗效顺序：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇》5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯。该实验证明了式(i)化合物对乳腺肿瘤细胞的破坏能力。这些结果与上述在24小时和48小时进行的观察结果一致。
[0181]
实施例21：化合物5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯或dx107对mcf-7细胞中胆固醇环氧化物水解酶(cheh)活性的作用：
[0182]
化合物5,6α-环氧胆固醇(5,6α-ec)和5,6β-环氧胆固醇(5,6β-ec)是他莫昔芬(一种广泛使用的抗肿瘤药物)的抗癌药理学中涉及的羟固醇。二者通过酶(胆固醇-5,6-环氧化物水解酶(cheh))被代谢为胆甾烷-3β,5α,6β-三醇(ct)，并且ct通过酶hsd11b2(11β-羟基类固醇脱氢酶2)被代谢为6-氧代-胆甾烷-3β,5α-二醇(ocdo)(一种甾酮(oncosterone)肿瘤促进剂)。以下实验的目的是证明5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯用于阻断cheh的能力，从而限制甾酮(一种肿瘤促进剂代谢产物)的代谢。
[0183]
使mcf-7细胞处于与实施例20的细胞培养基相同的细胞培养基中，并以150000个细胞/孔接种在6孔板中，其中每个处理条件有3个孔。接种后24小时，用[
14
c]5,6α-ec(1000x储备溶液：0.6mm；20μci/μmol；最终浓度0.6μm)单独或与他莫昔芬(tam)联合处理mcf-7细胞。他莫昔芬被用研究化合物的阳性对照。根据本发明的化合物的处理以1μm的浓度进行。
[0184]
处理24小时后，收集培养基，并通过用100μl氯仿、400μl甲醇和300μl水提取，来从细胞颗粒中制备脂质提取物。使用乙酸乙酯(etoac)作为洗脱剂，通过薄层色谱法(tlc)分析脂质提取物。用读板器，然后通过放射自显影术进行分析。
[0185]
结果呈现在图7中。我们观察到环氧化物对ct和ocdo的几乎完全代谢(孔1)，他莫
昔芬对cheh活性的完全抑制以及5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇的几乎完全抑制(痕量ct)。对于5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-丙酸酯，相对于对照(1)观察到cheh的抑制作用，但其低于阳性对照(2)和5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇。基于这些结果，推断出以下疗效顺序：5α-羟基-6β-[2-(1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-醇》5α-羟基-6β-[2](1h-咪唑-4-基)-乙基氨基]-胆甾烷-3β-基丙酸酯。总之，研究化合物对cheh具有抑制作用。观察到，疗效顺序与实施例20中对于针对mcf-7细胞处理24小时后观察到的形态学变化所确立的顺序相同。
[0186]
实施例22：dx101前药对4t1细胞的细胞毒性研究
[0187]
对表征为阴性三联体(her2-、er-、pr-)的鼠乳腺肿瘤4t1细胞进行细胞存活率测试。
[0188]
对于该实验，制备了细胞培养基。培养基由包含4.5g/l葡萄糖和l-谷氨酰胺的dulbecco改良eagle培养基(dmem，由westburg基于参考号lo be12-604f出售)组成，其中添加有10％胎牛血清(fcs)和50u/ml青霉素/链霉素。将4t1细胞引入该培养基中。
[0189]
以2000个4t1细胞/孔接种96孔板。在正常条件(即在37℃的温度在5％ co2的情况下在培养箱中)下培养72小时(h)后，用100nm、1μm、2.5μm和10μm的dx101、dx107、dx113、dx117、dx119、dx121或dx131处理4t1细胞48小时。也使用上述方案但在不使用分子dx101、dx107、dx113、dx117、dx119、dx121、dx131或dx133进行处理的情况下并行进行对照条件(ctl)
[0190]
通过三种不同的方法测量细胞存活率。对于第一种方法，在48小时时进行mtt标记。该测试基于四唑鎓盐mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)的使用。四唑鎓通过活性的活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为甲赞，甲赞是一种紫色的沉淀物。形成的沉淀物的量与活细胞的量成比例，而且也与每个细胞的代谢活性成比例。因此，通过光谱法简单地确定540nm处的光密度揭示了活细胞和代谢活性细胞的相对量。48小时后，吸取培养基，将细胞用mtt(在培养基中为0.5mg/ml)温育约3小时。吸取mtt溶液，并将紫色晶体溶解于二甲基亚砜(dmso)中。在550nm处测量od(光密度)。然后在每个孔中确定相对于ctl的存活率，并使用非线性回归直线(log(抑制剂)相对于响应)用prism软件确定每个分子的ic50(对于仍有50％活细胞的浓度)。
[0191]
对于第二种方法，通过使用试剂盒非放射性细胞毒性测定试剂盒(promega)测定细胞上清液中的酶ldh(乳酸脱氢酶)的活性来确定存活率百分比。ldh是一种在死细胞的上清液中释放的酶。上清液中ldh活性越高，细胞死亡率越大。在该酶测试中，释放的ldh将紫色四唑鎓盐转化为红色甲赞，在490nm处吸收。红色的强度与死亡细胞的数量成正比。处理48小时后，将上清液转移到新的96孔板中，并在室温在底物混合物的存在下温育30分钟。使用停止缓冲液停止反应，并在490nm处确定吸光度。这里使用100％最大ldh活性对照(用在即将加入底物混合物之前，在37℃在溶胞溶液的存在下温育45分钟的未经处理的细胞进行)来确定细胞死亡的百分比，然后从该百分比推断每个孔中的细胞存活率。然后，如前述段落所说明的，确定ic
50
。
[0192]
对于第三种方法，使用试剂盒celltox green细胞毒性测定(promega)确定存活率百分比。该测定通过膜完整性的变化来测量细胞死亡。该测定使用花色素苷类型的探针，当
细胞存活时，花色素苷类型的探针不会进入细胞，但花色素苷类型的探针会与死细胞的dna结合，死细胞的dna对探针是可渗透的，使其发荧光。因此，孔中的荧光度越高，细胞死亡率就越大。处理48小时后，将细胞在室温在celltox green试剂存在下温育最少15分钟，并在λ
发射
485nm/λ
激发
590nm处读取荧光度。使用100％细胞死亡对照(针对在即将加入celltox green试剂之前，在37℃在溶胞溶液的存在下温育30分钟的未经处理的细胞进行)来确定细胞死亡的百分比，然后根据该百分比推断每个孔中的细胞存活率。然后，如上述所说明的来确定ic
50
。
[0193]
这些测定的ic
50
结果如表2a、2b和2c中所呈现。在这些表中：-a
通过将化合物的logic
50
与dx101的logic
50
进行比较，并通过min n＝3和单向方差分析检验和随后的dunn后检验来计算显著性阈值-nb表示对于每个条件在4至10次重复的情况下独立测试数量。
[0194]
表2a：表2a：
[0195]
表2b：
[0196]
表2c：表2c：
[0197]
如表2a、2b和2c所示，对于dx107的活性，ic
50
与dx101的ic
50
相当，表明其细胞毒性活性类似于dx101的细胞毒性活性。此外，测试的其它分子dx113、dx117、dx119、dx121、
dx131和dx133的活性低于dx101的活性或与dx101的活性相当。
[0198]
实施例23：dx101前药对bt-474细胞的细胞毒性研究
[0199]
还对bt-474人乳腺肿瘤细胞(特征为阳性三联体her2 、er 、pr )进行了细胞存活率测试。使bt-474细胞处于与先前实施例相同的细胞培养基中，并以70000个细胞/孔接种在24孔板中，以使用台盼蓝进行细胞存活率确定，或以13000个细胞/孔接种在96孔板中以使用mtt或ldh进行细胞存活率确定。在正常条件(即在37℃的温度在5％ co2的情况下在培养箱中)下培养96小时后，将bt-474细胞用100nm、1μm、2.5μm和10μm的dx107和dx113处理48小时。也使用以上描述的方案但在不用分子dx101、dx107、dx113、dx117、dx119、dx121或dx131进行处理的情况下进行对照。
[0200]
在37℃进行胰蛋白酶消化10分钟后，还通过在使用biorad tc20设备(tc20
tm
自动细胞计数器)进行自动计数的情况下通过台盼蓝测定对细胞存活进行定量。台盼蓝测定基于细胞膜完整性，细胞膜在死细胞中被破坏。台盼蓝将死细胞染成蓝色。biorad tc20细胞计数器计算关于细胞百分比的蓝色细胞和非蓝色细胞的比例。然后确定每个孔中相对于未处理细胞的存活率百分比，并如前述实施例中所说明的确定ic
50
。结果示出于表2中。如先前实施例中所述进行的，使用mtt和ldh测定来确定bt-474细胞的存活率百分比。结果也示出于表2中。
[0201]
这些测定的ic
50
结果呈现在表3a、3b和3c中。在这些表中：-a
通过将化合物的logic
50
与dx101的logic
50
进行比较，并通过min n＝3和单向方差分析检验和随后的dunn后检验来计算显著性阈值-nb表示对于每个条件在4至10次重复的情况下独立测试数量。
[0202]
表3a：
[0203]
表3b：
[0204]
表3c：从表3a、3b和3c中可以看出，在这一行，dx107的活性与dx101的活性相似，并且dx113的活性低于dx101的活性。dx117的活性看上去与dx101的活性相当，而其它测试化合物dx119、dx121和dx131的活性看上去低于dx101的活性。
[0205]
实施例24：前药dx107对体内肿瘤生长的影响
[0206]
经伦理委员会批准后，对动物进行的所有程序均按照我们的机构指南进行。如前所述培养4t1细胞，在胰蛋白酶中解离，用冷pbs洗涤两次，并重悬于150万/ml pbs中。通过将100μl中的15万个细胞皮下移植到雌性balb/c小鼠(9周，1月)的翼侧中获得4t1肿瘤。当肿瘤达到50-100mm3的体积时，用40mg/kg dx101或40mg/kg dx111或对照载体(水)给小鼠灌胃。每天进行处理，直到实验结束(肿瘤体积》1000mm3)。每天使用测径规确定肿瘤体积，并根据下式计算：1/2
×
(长度*宽度2)。根据下式确定肿瘤生长抑制的百分比：100
×
(1-(第8天的肿瘤体积/第0天的肿瘤体积)
dx111
)/(1-(第8天的肿瘤体积/第0天的肿瘤体积)
载体
)。
[0207]
kaplan-meier方法用于比较动物的存活率。
[0208]
图4a显示dx107在减少肿瘤生长方面比dx101具有更大的效果(***p＜0.001，单向方差分析检验和tukey后检验)。此外，用dx107处理的动物的肿瘤生长抑制率确定为78％，而用dx101处理的动物确定为58％。
[0209]
此外，对动物存活率的分析也示于图4b中，表明与dx101相比，用dx107处理的动物的中位存活率显著更高(对数秩mantal-cox检验，*p《0.05)。
[0210]
在图4b中，得到的结果如下：
[0211]
尽管已经结合多个特定实施方式描述了本发明，但很明显，本发明并不以任何方式限制于这些特定实施方式，并且本发明包括所描述的手段的所有技术等同方案以及其组合，如果后者落在本发明的范围内的情况下。
[0212]
动词“包括”或“包含”及其缀合形式的使用并不排除权利要求中所述的其它要素或其它步骤以外的要素或步骤的存在。
[0213]
在权利要求中，括号中的任何参考符号都不应被解释为对权利要求的限制。