一株可调节骨骼发育的短双歧杆菌及其应用

1.本发明涉及一株可调节骨骼发育的短双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.骨骼是人体重要的器官，与我们健康息息相关。目前对于骨骼疾病及发育的预防和治疗主要包括药物干预及非药物干预，药物干预即为缓解疼痛的非疾病特异性药物；非药物干预就是通过改变生活方式、日常补充营养物质等方式促进骨骼发育；随着研究的不断进步，治疗方法的不断发展确实能够在一定程度上改善骨骼发育，但仍有一部分人会出现不良反应。
3.肠道和骨组织通过由肠道微生物群调节的复杂网络相互作用，一些荟萃分析发现肠道菌群的改变与调节骨量、骨骼发育、骨代谢息息相关。恢复肠道菌群对治疗骨骼相关疾病具有积极作用。在出生后，肠道主要以双歧杆菌为优势菌群，主要为短双歧杆菌、短双歧杆菌及两歧双歧杆菌。肠道菌群的健康发展有助于幼时骨骼的健康发展，而肠道菌群的紊乱则会影响骨骼发育，肠道微生物群的调节可以通过饮食、生活方式来实现，也可以通过益生菌、益生元、合生元、抗生素、粪菌移植等各种干预来实现。
4.近年来，有研究表明益生菌可以减少动物模型的肠道和骨骼的炎症，提高肠道通透性，防止骨质流失。因此，急需找到一株可调节生命早期哺乳动物骨骼发育的益生菌。


技术实现要素：

5.本发明提供了短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ccfm1078在制备有助于增强骨骼发育的药物或保健品中的应用，所述短双歧杆菌ccfm1078保藏编号为gdmcc no：61011，已公开于公开号为cn112111424b的专利文件中。
6.在一种实施方式中，所述有助于增强骨骼发育包括但不限于提高生命早期哺乳动物股骨长度及骨骼稳态。
7.在一种实施方式中，所述产品用于调节生命早期哺乳动物肠道菌群。
8.在一种实施方式中，所述调节股骨长度及骨骼稳态包括如下至少一种作用：
9.(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；
10.(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；
11.(3)降低生命早期哺乳动物血清甲状旁腺激素水平；
12.(4)提高生命早期哺乳动物血清1,25二羟基维生素d3水平；
13.(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；
14.(6)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；
15.(7)提高生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平
16.(8)降低生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；
17.(9)降低生命早期哺乳动物血清中破骨细胞分化因子水平；
18.(10)降低生命早期哺乳动物血清中i型胶原n末端肽水平。
19.本发明还提供所述短双歧杆菌ccfm1078在制备有助于调节肠道菌群的保健品中的应用。
20.在一种实施方式中，所述调节肠道菌群包括但不限于(1)～(3)至少一种：
21.(1)提高生命早期哺乳动物肠道中乳杆菌相对丰度；
22.(2)降低生命早期哺乳动物肠道中alistipes相对丰度；
23.(3)降低生命早期哺乳动物肠道中ruminococcaceae ucg-014相对丰度。
24.在一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人。
25.在一种实施方式中，所述药物或保健品是含有所述短双歧杆菌ccfm1078的益生菌剂。
26.在一种实施方式中，所述益生菌剂中短双歧杆菌ccfm1078的活菌数不低于1
×
109cfu/ml或1
×
109cfu/g。
27.在一种实施方式中，所述药物含有所述短双歧杆菌和药学上可接受的载体。
28.本发明还提供所述短双歧杆菌ccfm1078在制备有助于增强骨骼发育的保健品中的应用。
29.有益效果：
30.1、本发明提供了短双歧杆菌ccfm1078在调节股骨长度及骨骼稳态及调节肠道菌群方面的新用途，具体体现在：
31.(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；
32.(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；
33.(3)降低生命早期哺乳动物血清甲状旁腺激素水平；
34.(4)提高生命早期哺乳动物血清1,25-二羟维生素d3水平；
35.(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；
36.(6)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；
37.(7)提高生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平
38.(8)降低生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；
39.(9)降低生命早期哺乳动物血清中破骨细胞分化因子水平；
40.(10)降低生命早期哺乳动物血清中i型胶原n末端肽水平；
41.(11)提高生命早期哺乳动物粪便中乳杆菌相对丰度；
42.(12)降低生命早期哺乳动物粪便中alistipes相对丰度；
43.(13)降低生命早期哺乳动物粪便中ruminococcaceae ucg-014相对丰度。
44.2、本发明筛选的短双歧杆菌ccfm1078为食品安全菌株，可用于制备调节股骨长度及骨骼稳态的产品，具有巨大的应用前景。
45.3、本发明的短双歧杆菌的培育过程仅需培养基以及一些培养条件的控制，成本相对低廉，易于实现工业化生产。
附图说明
46.图1：不同组生命早期哺乳动物股骨长度；*,与control组相比，p《0.05；
47.图2：不同组生命早期哺乳动物血清生长激素水平；*,与control组相比，p《0.05；
48.图3：不同组生命早期哺乳动物血清甲状旁腺激素水平；*,与control组相比，p《
0.05；
49.图4：不同组生命早期哺乳动物血清1,25-二羟维生素d3水平；*,与control组相比，p《0.05；
50.图5：不同组生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；*,与control组相比，p《0.05；图6：不同组生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；*,与control组相比，p《0.05；
51.图7：不同组生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平；*,与control组相比，p《0.05；
52.图8：不同组生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；*,与control组相比，p《0.05；
53.图9：不同组生命早期哺乳动物血清中破骨细胞分化因子水平；*,与control组相比，p《0.05；
54.图10：不同组生命早期哺乳动物血清中i型胶原n末端肽水平；*,与control组相比，p《0.05；
55.图11：不同组生命早期哺乳动物粪便中乳杆菌相对丰度；*,与control组相比，p《0.05；
56.图12：不同组生命早期哺乳动物粪便中alistipes相对丰度；*,与control组相比，p《0.05；
57.图13：不同组生命早期哺乳动物粪便中ruminococcaceae ucg-014相对丰度；*,与control组相比，p《0.05。
具体实施方式
58.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
59.下述实施例中涉及的balb/c小鼠购自浙江维通利华公司；下述实施例中涉及的短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ccfm1078由江南大学食品学院生物技术中心分离得到；
60.下述实施例中涉及的检测试剂如下：
61.生长激素、甲状旁腺激素、1,25-二羟维生素d3等指标的elisa试剂盒购自福麦斯。
62.下述实施例中涉及的培养基如下：
63.mrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、琼脂15g/l。
64.mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1ml/l。
65.实施例1：短双歧杆菌菌悬液的制备
66.短双歧杆菌ccfm1078菌液按如下方法制备：
67.蘸取短双歧杆菌菌液在mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，得到单菌落；
68.挑取单菌落接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照
1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；
69.将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；
70.将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用生理盐水缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用生理盐水将乳酸菌菌体重悬至细胞浓度为1
×
109cfu/ml，得到短双歧杆菌ccfm1078菌悬液。
71.实施例2：短双歧杆菌ccfm107对雌雄幼鼠股骨长度的影响
72.取6周龄的雄性无病原体(spf)balb/c雌鼠8只，雄鼠4只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，按照雌雄2：1合笼，待雌鼠怀孕后，拿出雄鼠，妊娠期3周，幼鼠出生1周龄开始灌胃，分为control组(灌胃生理盐水)，ccfm1078(灌胃短双歧杆菌ccfm1078)。
73.动物适应性饲养1周后开始实验，实验共8周。具体处理如下：
74.对照组(control)：出生后1周开始灌胃200μl生理盐水；
75.短双歧杆菌ccfm1078组：出生后1周开始灌胃10μl对应菌悬液，使灌胃剂量为1
×
109cfu/只/天。
76.灌胃至5周龄，实验结束后，取雌雄幼鼠全血，离心后取血清，用游标卡尺量取小鼠股骨长度，测定结果分别见图1。
77.由图1可知，雌鼠正常组股骨长度为11.41mm，雌鼠ccfm1078组为11.93mm；雄鼠正常组股骨长度为11.84mm，雄鼠ccfm1078组为12.23mm。
78.实施例3：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠血清生长激素水平的影响
79.小鼠的分组和造模同实施例2。取雌雄幼鼠血清，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清生长激素水平，结果见图2。
80.生长激素能够促进生长，促进骨、软骨、肌肉和其他组织细胞的分裂增殖和蛋白质的合成，从而加速骨骼和肌肉的生长发育ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清生长激素水平显著高于正常组；雌鼠正常组血清生长激素浓度为14.12μg/l，雌鼠ccfm1078组为15.98μg/l；雄鼠正常组血清生长激素浓度为16.22μg/l，雄鼠ccfm1078组为18.07μg/l。
81.实施例4：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄鼠血清甲状旁腺激素水平的影响
82.小鼠的分组及处理同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中甲状旁腺激素水平，检测结果见图3。
83.甲状旁腺激素调节血钙与骨钙平衡，甲状旁腺激素降低说明血钙浓度低，用于骨骼组织生长的钙并没有入血。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清甲状旁腺激素水平显著低于正常组；雌鼠正常组血清甲状旁腺激素浓度为60.87ng/l，雌鼠ccfm1078组为49.39ng/l；雄鼠正常组血清甲状旁腺激素浓度为62.52ng/l，雄鼠ccfm1078组为50.58ng/l。
84.实施例5：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄鼠血清1,25(oh)2d3水平的影响
85.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中1,25(oh)2d3水平，结果见图4。
86.1,25(oh)2d3可直接作用于骨的矿物质代谢，促进骨基质形成及类骨质矿化。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清1,25(oh)2d3水平显著高于正常组；雌鼠正常组血清1,25(oh)2d3浓度为34.23ng/l，雌鼠ccfm1078组为40.15ng/l；雄鼠正常组血清1,25(oh)2d3浓度为38.09ng/l，雄鼠ccfm1078组为45.62ng/l。
87.实施例6：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄鼠血清骨钙素水平的影响
88.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中骨钙素水平，检测结果见图5。
89.骨钙素是反映成骨细胞功能敏感标志，在诊断和治疗骨质疏松和钙代谢疾病当中非常的重要。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清骨钙素水平显著高于正常组；雌鼠正常组血清骨钙素浓度为23.48ng/l，雌鼠ccfm1078组为27.47ng/l；雄鼠正常组血清骨钙素浓度为24.54ng/l，雄鼠ccfm1078组为31.98ng/l。
90.实施例7：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄鼠血清类胰岛素1号生长因子水平的影响
91.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中类胰岛素1号生长因子水平，结果见图6。
92.类胰岛素一号生长因子也被称作“促生长因子”。在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义，可促进骨的合成代谢并保持其正常结构功能。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清类胰岛素1号生长因子水平显著高于正常组；雌鼠正常组血清类胰岛素1号生长因子浓度为24.39μg/l，雌鼠ccfm1078组为27.77μg/l；雄鼠正常组血清类胰岛素1号生长因子浓度为26.04μg/l，雄鼠ccfm1078组为30.12μg/l。
93.实施例8：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄鼠血清i型胶原n端前肽水平影响
94.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中i型胶原n端前肽水平，结果见图7。
95.血清中i型前胶原氨基末端肽为反映骨形成敏感性较高的标志物。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清i型胶原n端前肽水平显著高于正常组；雌鼠正常组血清i型胶原n端前肽浓度为8.79μg/l，雌鼠ccfm1078组为9.92μg/l；雄鼠正常组血清i型胶原n端前肽浓度为10.22μg/l，雄鼠ccfm1078组为11.74μg/l。
96.实施例9：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠血清骨保护素水平的影响
97.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中骨保护素水平，检测结果见图8。
98.骨保护素可抑制破骨细胞发生，促进成熟破骨细胞凋亡。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清骨保护素水平显著高于正常组；雌鼠正常组血清骨保护素浓度为0.73μg/l，雌鼠ccfm1078组为0.96μg/l；雄鼠正常组血清骨保护素浓度为0.87μg/l，雄鼠ccfm1078组为0.99μg/l。
99.实施例10：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠破骨细胞分化因子影响
100.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中破骨细胞分化因子水平，结果见图9。
101.破骨细胞分化因子过表达，可导致一系列骨疾病，如风湿性关节炎，银屑病关节炎。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清破骨细胞分化因子水平显著低于正常组；雌鼠正常组血清破骨细胞分化因子浓度为372.55pmol/l，雌鼠ccfm1078组为316.55pmol/l；雄鼠正常组血清破骨细胞分化因子浓度为404.61pmol/l，雄鼠ccfm1078组为352.04pmol/l。
102.实施例11：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠i型胶原n末端肽水平影响
103.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中i型胶原n末端肽水平，结果见图10。
104.i型胶原交联n-末端肽是反应骨吸收状况最敏感、最特异的指标。该指标偏低说明骨吸收降低，有助于骨骼发育。ccfm1078灌胃后雌雄鼠血清i型胶原n末端肽水平显著低于正常组；雌鼠正常组血清i型胶原n末端肽浓度为5.39μg/l，雌鼠ccfm1078组为4.48μg/l；雄鼠正常组血清i型胶原n末端肽浓度为5.69μg/l，雄鼠ccfm1078组为4.92μg/l。
105.实施例12：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠粪便乳杆菌相对丰度的影响
106.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，收集小鼠粪便，通过fastdna spin kit(美国mp生物医药公司)提取粪便中的基因组dna，对提取得到的基因组dna的v3-v4区进行特异性pcr扩增，16s rdna测序，分析粪便菌群变化，分析结果见图11。
107.由图11可知，ccfm1078灌胃后雌雄鼠粪便乳杆菌相对丰度显著高于正常组，雌鼠control组的乳杆菌相对丰度为0.12，ccfm1078组为0.43；雄鼠control组的乳杆菌相对丰度为0.09，ccfm1078组为0.47。
108.实施例13：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠粪便alistipes相对丰度的影响
109.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，收集小鼠粪便，通过fastdna spin kit(美国mp生物医药公司)提取粪便中的基因组dna，对提取得到的基因组dna的v3-v4区进行特异性pcr扩增，16s rdna测序，分析粪便菌群变化，分析结果见图12。
110.由图12可知，ccfm1078灌胃后雌雄鼠粪便alistipes相对丰度显著低于正常组，雌鼠control组的乳杆菌相对丰度为0.09，ccfm1078组为0.01；雄鼠control组的alistipes相对丰度为0.07，ccfm1078组为0.03。
111.实施例14：短双歧杆菌ccfm1078对雌雄幼鼠粪便ruminococcaceae ucg-014相对丰度的影响
112.小鼠的分组和造模同实施例2。实验结束后，收集小鼠粪便，通过fastdna spin kit(美国mp生物医药公司)提取粪便中的基因组dna，对提取得到的基因组dna的v3-v4区进行特异性pcr扩增，16s rdna测序，分析粪便菌群变化，分析结果见图13。
113.由图13可知，ccfm1078灌胃后雌雄鼠粪便ruminococcaceae ucg-014相对丰度显著高于正常组，雌鼠control组的乳杆菌相对丰度为0.04，ccfm1078组为0.006；雄鼠control组的ruminococcaceae ucg-014相对丰度为0.02，ccfm1078组为0.006。
114.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。